鏈霉菌streptomycessp.s27來源的β1，3葡聚糖酶和β甘露糖苷酶的基因克隆與性質(zhì)研究

1、蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文鏈霉菌Streptomyces sp.S27來源的β-1，3-葡聚糖酶和β-甘露糖苷酶的基因克隆與性質(zhì)研究姓名：姚國玉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳強(qiáng);姚斌20090501蘭州大學(xué)2 0 0 9 屆碩士學(xué)位論文A b s t r a c tS t r e p t o m y c e $ i sa l li m p o r t a n t r e s o u r c e - r i c

2、 ha n t a g o n i s t i cm i c r o o r g a n i s ma n d i sw i d e l y u s e d i ni n d u s t r y ,a g r i c u l t u r ea n de n v i r o n m e n t a ls c i e n c e s ．I nt h i s s t 畎I y ’S t r e p t o m y c 緲s p ．$ 2 7w

3、 a ss e l e c t e d 嬲t h e r e s e a r c ho b j e c t sb a s e d o n t h e e v a l u a t i o no f s p e c i e s - n o v e l t ya n de n z y m e p r o d u c t i o nc a p a c i t y ．S t r e p t o m y c e ss p ．$ 2 7W a Si

4、s o l a t e d f r o mt h eH a m i n gM o u n t a i ni nt h eT u r p a nB a s i no fX i n j i a n gU y g n r A u t o n o m o u sR e g i o n ,C h i n a ．B y u s i n gb i o i n f o r m a t i c a l m e t h o d s ，t h ea m i

5、n o a c i ds e q u c o ∞o f S t r e p t o m y c e s p r o d u c e d p l ，3 - g l u c a n a s ef r o mg l y c o s i d eh y d r o l a s e ( a } I ) f a m i l y1 6w c r ea l i g n e da n da n a l y z e d ．A s e to fd e g e

6、n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e d o n t h ec o n s e r v e d m o t i f s ．G e n ef r a g m e n t s o f 爭l ，3 - g l u c a n a s e f r o m S t r e p t o m y c e sW S S c l o n e db yu s i n gd e g e n

7、 e r a t e dP C Rm e t h o d ．T h ef u l l l e n g t h g e n eb g l S 2 7w a so b t a i n e d b yc o m b i n a t i n gw i t hg e n o m i c l i b r a r ys c r e e n i n ga n dT A I LP C R , a n d s u c c e s s f u l l ya

8、【p 鵬s s e di nE s c h e r i c h i ac o l iB L 2 1 ( D E 3 ) ．T h e b g l S 2 7 g e n ec o n t a i n s1 , 3 6 2b pa n d e n c o d e sap r o t e i no f 4 5 3a m i n o a c i d sw i t h ac a l c u l a t e dm o l e c u l a r郵

9、s o f 4 2 ．7k D a ．T h e m a t u r e p r o t e i n c o m p r i s e s a c a t a l y t i cm o d u l e o fg l y c o s y lh y d r o l a s e ( G H ) f a m i l y 1 6 ，a s h o r t g l y c i n el i n k e r r e , o n , a n da f a

10、 m i l y 1 3 c a r b o h y d r a t e - b i n d i n g m o d u l e ( C B M ) ．T h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n t e l l z y m es h o w e d o p t i m a l a c t i v i t y a t 6 5 。Ca n dp H5 ．5 ，a n d p r e f e r e n t

11、 i a l l y c a t a l y z e d t h eh y d r o l y s i so f g l u c a n sw i t hp ．1 ，3 - l i n k a g ew i t ha ne n d o l y t i cm o d eo f a c t i o n ．S p e c i f i ca c t i v i t ya n d 靦v a l u eo f B g l S 2 7 f o rl

12、a m i n a r i n W a S 3 0 4 ．2U m f l a n d1 ．8 9m g m l - 1 ，r e s p e c t i v e l y ．I na n t i f u n g a la s s a y , B g l S 2 7 h a da b i l i t y t o i n h i b i t t h eg r o w t ho f t 姍t n e m y c o t o x i n - p

13、 r o d u c i n gf u n g i ，s u c h 鷦F u s a r i u m G r a m i n e a r u m ，F(xiàn) u s a r i u m c r o o l a ‘，e l l e n s e , a n d P a e c i l o m y c e s v a r i o t i i ，a n dp h y t o p a t h o g e n i c f u n g u sR h i

14、z o c t o n i cs o l a n i ．T h e s ef a v o r a b l ep l q p c 而鷦i n a k e B g l S 2 7ag o o d c a n d i d a t ef o r u ∞i n f o o d a n d f o o d p r e s e r v a t i o n , p l a n t p r o t e c t i o n ,a n d o t h e r

15、 b i o t e e h n o l o g i e a la p p l i c a t i o n s ．A p a i ro fp r i m e r s w e ∞d e s i g n e d b a s e d o n t h e g o n ef r a g m e n to f p m a n n o s i d a s ef r o m S t r e p t o m y c e ss p ．$ 2 7 t oc

16、l o n e t h ef u l ll e n g t hg e n e ，m a n S 2 7 ，b y s c r e e n i n gt h e g e n o m i c l i b r a r yf r o mS t r e p t o m y c e ss p ．$ 2 7 ．T h e g e n e r o a n S 2 7 c o n t a i n s2 , 4 9 6b p a n d e n o o d

17、 e 想a p r o t e i no f8 3 2 8 1 n i n ea c i d sw i t h a c a l c u l a t e dm o l e c u l a rm 啵o f 9 2 ．5 k D a ．T h eg o n e r o a n S 2 7w a s i n s e r t e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r o fp E T -

18、2 2 b ( + ) a n dt r a n s f o r m e d i n t o E s c h e t i c h i a c o l i B L 2 l ( D E 3 ) t o a 【p 懈s t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n M a n S 2 7 ．C h a r a c t e r i z a t i o no f M a n S 2 7 i n d i c a

19、 t e dt h a tt h e o p t i m u m t e m p e r a t u r ea n d p H W e l ' c 5 0 。Ca n d p H 7 ．0 ，a n d t h es p e c i f i ca c t i v i t ya n d K m v a l u eo f M a n S 2 7 w e r e 3 0 4 ．2U m f l a n d1 ．8 9m g m l -

20、 1 ，r e s p e c t i v e l y ．T h er e s u l to ft r a n s g l y c o s y l a t i ce x p e r i m e n t s h o w e d t h a tM a n S 2 7 h a d t h e a c t i v i t y o f t r a n s g l y c o s y l a t i o n ·I nt h i ss t

21、u d y , aB - l ，3 - g l u c a n a s eg e n e a n da [ 3 - m a n n o s i d a s eg e n e w e r ec l o n e df r o m S t r e p t o m y c e s s p ．$ 2 7 ．B y c o n s t r u c t i n g a n d t r a n s f o r m a t i n g e x p r e

22、 s s i o n v e c t o r t o E s c h e t i c h i a c o l i , w eh a v e o b t a i n e dr e c o m b i n a n t sw h i c h a r e p r o m i s i n g i na p p l i c a t i o n so f c o n s t r u c t i n gt h e c o m m e r c i a l

23、 i z e d h i g h - y i e l d i n g 8 t r a i l 塢a n d m o l e c u l a r b i o l o g i c a lr e s e a r c h o n e n z y m y ．K e y w o r d ：S t r e p t o m y c e s ；p l ，3 - O u e a n a ∞；B - m a n n o s i d a s e ；p r o