木霉β-1，3-葡聚糖酶的分離純化、性質(zhì)和部分結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、β-1，3-葡聚糖是一種生物活性強(qiáng)、毒副作用低的高效生物應(yīng)答物，但目前常用的堿法提取得到的β-1，3-葡聚糖水溶性差，使其應(yīng)用受到了很大限制。利用β-1，3-葡聚糖酶對(duì)β-1，3-葡聚糖進(jìn)行酶解增溶，將極大地拓寬其在醫(yī)藥、食品及化妝品等行業(yè)中的應(yīng)用。本試驗(yàn)以研究室分離得到的木霉菌株LE02為研究對(duì)象，采用鹽析沉淀、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、電泳、薄層層析、等點(diǎn)聚焦電泳、紫外差光譜及圓二色譜等方法對(duì)其所產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶進(jìn)行分離純化

2、，并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，主要得出以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1、采用不同的沉淀方法分別對(duì)木霉菌株LE02所產(chǎn)胞外β-1，3-葡聚糖酶進(jìn)行沉淀。在三種沉淀方法中，硫酸銨分段鹽析法優(yōu)于丙酮和乙醇沉淀。β-1，3-葡聚糖酶經(jīng)30％→80％的硫酸銨分段鹽析、透析濃縮后，僅用Sephadex G-200凝膠柱層析法得不到單一的酶蛋白；而直接采用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析可得到電泳純的酶蛋白，總酶活回收率78.71％，

3、比酶活689.93U／mg，比粗酶液提高了53.74倍。經(jīng)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，分別采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色和特異性活性染色，證實(shí)木霉菌株所產(chǎn)的胞外β-1，3-葡聚糖酶沒(méi)有同工酶，用SDS-PAGE法測(cè)得其分子量為80.137KDa，等電聚焦電泳測(cè)得該酶的等電點(diǎn)為7.0。 2、β-1，3-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在不超過(guò)50℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好、pH值在4.5-6.0范

4、圍內(nèi)酸堿穩(wěn)定性較好。Co<'2+>、K<'+>、Zn<'2+>、Li<'+>、Ba<'2+>、Cu<'2+>、1％β-巰基乙醇對(duì)該酶基本沒(méi)有影響，Cd<'2+>、10.0mmol／L的Mg<'2+>以及5mmol／L和10mmol／L的Fe<'2+>對(duì)該酶具有部分抑制作用，而0.6mol／L的尿素、低濃度的Hg<'2+>、5.0mmol／L以上的Mn<'2+>和10.0mmol／L以上的Fe<'3+>能強(qiáng)烈抑制該酶的活性；1.0mmol

5、／L，DTT和0.1％SDS對(duì)該酶具有一定的激活作用。利用雙倒數(shù)作圖法研究Fe<'3+>和尿素對(duì)酶的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e<'3+>對(duì)酶的作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，而尿素對(duì)該酶的作用為混合型抑制類型。該酶只能作用于β-1，3-糖苷鍵，當(dāng)以Laminarin（昆布多糖）為底物時(shí)，β-1，3-葡聚糖酶的米氏常數(shù)K<,m>值為128.34μg／mL，最大反應(yīng)速度V<,m>為23.01μg／min.mL。經(jīng)薄層層析進(jìn)一步證明，該酶為內(nèi)切β-1，3-