結核分枝桿菌重組融合蛋白tb10.4hsp16.3納米金生物傳感器診斷結核病的研究

1、分類號學校代碼 ! Q 5 壘2密級學號2 Q 1 3 Q 2 2 Q 1 5 1 壘結核分枝桿菌重組融合蛋白T B 1 0 ．4 一H s p 1 6 ．3納米金生物傳感器診斷結核病的研究D i a g n o s i s o f t u b e r c u l o s i sw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s b i o s e n s o r b a s e d o n t h er e

2、 c o m b i n a n t f u s i o n p r o t e i nT B 1 0 ．4 一H s p 1 6 ．3o fM y c o b a c t e r i a t u b e r c u l o s i s指導教師姓名、職稱 盔垡薹塾撞湖南師范大學學位評定委員會辦公室二零一六年五月 一苓一六年直月摘 要目的：克隆并表達結核分枝桿菌重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，分析其診斷結核

3、病的價值；并建立基于重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 診斷結核病的納米金生物傳感器，為結核病的血清學診斷提供新的實驗依據(jù)和技術支持。方法：( 1 ) 根據(jù)G e n B a n k 中結核分枝桿菌T B l 0 ．4 、H s p l 6 ．3 的基因序列設計并合成引物，以結核分枝桿菌H 3 7 R v 基因組D N A 為模版，聚合酶鏈反應( P C R ) 擴增T B l 0 ．4 和H s p l 6

4、．3 的基因片段，重疊延伸P C R 技術擴增融合基因T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，克隆至p M D l 8 - T 載體，菌落P C R 和測序鑒定，將序列正確的融合基因T B l 0 ．4 一H s p l 6 ．3亞克隆至表達載體p E T 2 8 a ( + ) ，P C R 和雙酶切鑒定陽性重組子。( 2 )將重組D N A 轉化E ．c o l iB L 2 1 ，篩選陽性菌株，異丙基p ．D ．硫代半

5、乳糖苷誘導表達融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，超聲裂解菌體，對包涵體進行變性溶解和復性，H i s —b i n d T M 柱層析( N i 2 + - N T A ) 純化重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，W e s t e r nb l o t 分析其免疫學活性，E L I S A 評價其診斷結核病的價值。( 3 ) 晶種成長法制備金納米棒，經(jīng)M U A 、E D C 、N

6、 H S 化學修飾后，與融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 連接，構建納米金生物傳感器，評價其對結核病的診斷價值。結果：( 1 ) 成功獲得約7 5 0 b p 的融合基因T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，構建了融合蛋白的重組表達質(zhì)粒p E T - T B l 0 ．4 一H s p l 6 ．3 。( 2 ) 表達、純化獲得分子量約2 9 k D a 的融合蛋白T B 1 0 ．4 一H s p