亞抑菌濃度抗生素對e.colipa接合反應(yīng)的影響

1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明： 所呈交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名日期：功I ≯年明了日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，

2、同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。( 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論支作者簽名赴論文導(dǎo)師簽名j 憋日期：撕鉗月7 日到的作用。眾所周知，抗生素具有抑制乃至殺滅細(xì)菌的作用，那怎么推測它具有促進(jìn)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的作用呢? 其實(shí)這并不矛盾，因?yàn)榭股匕l(fā)揮作用的前提是要達(dá)

3、到有效藥物濃度及作用時(shí)間。通?？股貙?xì)菌的作用具有濃度和時(shí)間依賴性，所以為達(dá)到抑制甚至殺滅細(xì)菌的作用，臨床應(yīng)用抗生素時(shí)需根據(jù)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)定時(shí)定量給藥，以維持抗生素濃度大于最低抑菌濃度( m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，M I C ) 。然而，實(shí)際上有多種因素導(dǎo)致到達(dá)感染部位的抗生素僅達(dá)到“亞M I C ”( s u b ．M I C ) 水平，

4、其中不規(guī)范用藥是一個(gè)重要原因；其次，細(xì)菌可形成了特殊結(jié)構(gòu)，比如P A 形成生物膜抵御抗生素；第三，人體器官的特殊結(jié)構(gòu)，如血腦屏障可阻止某些藥物進(jìn)入腦室；第四，因藥物在不同組織器官中的分布情況不同，以及受感染組織的血液供應(yīng)欠佳等：第五，細(xì)菌雖然被人體吞噬細(xì)胞吞噬，但因機(jī)體免疫力較低而未被殺滅，反而吞噬細(xì)胞成為了細(xì)菌的庇護(hù)所。在亞M I C 水平，抗生素殺滅不了細(xì)菌。本課題擬從臨床常用抗生素的亞抑菌濃度入手，探索亞抑菌濃度的抗生素在銅綠假單

5、胞菌接合反應(yīng)中所起的作用及相應(yīng)的分子機(jī)制。本課題擬從以下三方面展開研究：( 1 ) 首先優(yōu)化課題組前期建立的供體菌E ．c o l i與受體菌P A 的接合模型，使之適合抗生素的處理研究；( 2 ) 觀察比較抗生素對供體菌及受體菌的不同影響，然后研究亞M I C 濃度抗生素對細(xì)菌接合反應(yīng)的影響；( 3 )采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)( R N A —S e q ) 研究亞M I C 抗生素作用下細(xì)菌的差異表達(dá)基因，篩選接合反應(yīng)相關(guān)基因，進(jìn)行相關(guān)通

6、路的功能分析，并用熒光定量P C R 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果1 4 】，從而全面闡明亞M I C 抗生素對細(xì)菌接合反應(yīng)的影響。方法：1 ．優(yōu)化接合反應(yīng)模型①供體菌與受體菌供體菌Ec o l iS M I O L p i r ( ．p U C P 2 4 T ) ，受體菌P A 0 1 由美國羅切斯特大學(xué)B a r b a r a H ．I g l e w s k i 教授贈予。②濾膜雜交法與液體雜交法的比較濾膜雜交法與液體雜交法在接合前增菌

7、、藥物處理等步驟是相同的，不同點(diǎn)體現(xiàn)在供體菌與受體菌定量混合后，前者放在濾膜上雜交2 h ，后者放在液體環(huán)境下雜交2 h ，最后計(jì)算接合效率。③接合時(shí)間接合時(shí)間的選擇需要考慮影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素與整個(gè)實(shí)驗(yàn)的周期，前期處理，后續(xù)洗膜涂板，抗生素篩選，接合子長出后數(shù)板計(jì)數(shù)的時(shí)間等，嘗試了l h 、2 h 、4 h 。④構(gòu)建報(bào)告基因熒光檢測法與數(shù)板菌落計(jì)數(shù)法的結(jié)果熒光檢測法用的是雙質(zhì)粒抑制系統(tǒng)，接合前不發(fā)光，接合后抑制性質(zhì)粒丟失從而接合子中的質(zhì)