亞抑菌濃度抗生素對(duì)紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控研究.pdf

1、上世紀(jì)20年代末青霉素的發(fā)現(xiàn)，開(kāi)辟了抗生素治療的新時(shí)代，許多感染性疾病從此得到了有效控制。但是，隨著抗生素的廣泛使用、錯(cuò)用和濫用，細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，涌現(xiàn)出了大量的耐藥菌、多重耐藥菌甚至超級(jí)耐藥菌株，這些問(wèn)題已成為制約人類(lèi)生存和發(fā)展的極大危機(jī)。我們國(guó)家是世界上抗生素濫用最嚴(yán)重的國(guó)家之一，每年約有8萬(wàn)人死于抗生素泛濫使用導(dǎo)致的不良反應(yīng)，且死亡數(shù)量每年都在遞增，細(xì)菌耐藥問(wèn)題和其他國(guó)家相比更加嚴(yán)峻。因此，如何解決細(xì)菌耐藥難題和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶

2、點(diǎn)研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。研究表明抗生素在低于治療劑量即亞抑菌濃度(subinhibitory concentrations)條件下引起的生物學(xué)效應(yīng)是臨床上引起細(xì)菌耐藥的一個(gè)重要因素。因此研究抗生素亞抑菌效應(yīng)不僅對(duì)分析細(xì)菌耐藥機(jī)理、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)具有重要作用，而且抗生素在亞抑菌濃度下產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)對(duì)臨床給藥劑量和給藥時(shí)間都有非常重要的指導(dǎo)意義。
　　本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在紫色桿菌培養(yǎng)平板上卡那霉素抑菌圈外圍紫色菌素合成明顯

3、增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)證明這種增強(qiáng)作用是由亞抑菌濃度卡那霉素引起，且其在1/4、1/6、1/8 MIC時(shí)均明顯促進(jìn)紫色桿菌紫色菌素合成，其中1/6 MIC促進(jìn)效果高達(dá)25％。這種現(xiàn)象在臨床常見(jiàn)抗生素阿米卡星、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素中同樣存在，但促進(jìn)效果均不如卡那霉素明顯。由于紫色桿菌中紫色菌素合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)密切調(diào)控，我們采用熒光定量 PCR和生物報(bào)告菌株分析了亞抑菌濃度抗生素作用下紫色桿菌信號(hào)分子合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平和信號(hào)分子產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

4、亞抑菌卡那霉素明顯提高了群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和信號(hào)分子的產(chǎn)生。此外，群體感應(yīng)增強(qiáng)同時(shí)促進(jìn)了與其相關(guān)的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生和細(xì)菌生物被膜形成。進(jìn)一步研究顯示，在抗生素刺激下與紫色桿菌生物被膜形成相關(guān)的swimming, swarmming運(yùn)動(dòng)行為和聚集能力明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，亞抑菌濃度抗生素促進(jìn)紫色桿菌群體感應(yīng)行為發(fā)生。
　　c-di-GMP是細(xì)菌中普遍存在的第二信使，其調(diào)控的多種細(xì)菌行為如：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成等均與

5、群體感應(yīng)系統(tǒng)相互交叉，暗示c-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)和群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)。在本論文中，我們采用雙親接合轉(zhuǎn)化方式成功將來(lái)自大腸桿菌的c-di-GMP合成基因adrA導(dǎo)入紫色桿菌中。當(dāng)過(guò)表達(dá)adrA時(shí)，紫色桿菌群體感應(yīng)行為明顯受到抑制。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示adrA轉(zhuǎn)入后紫色桿菌群體感應(yīng)信號(hào)分子合成基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。信號(hào)分子定量分析也得到了一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的紫色菌素合成和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生都受到明顯抑制。這些結(jié)果

6、表明，adrA可能通過(guò)增加c-di-GMP合成量來(lái)調(diào)節(jié)紫色桿菌群體感應(yīng)行為。
　　傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP監(jiān)測(cè)方法是利用放射性同位素對(duì)c-di-GMP合成底物GTP進(jìn)行標(biāo)記，然后利用薄層層析和放射自顯影監(jiān)測(cè)胞內(nèi)的同位素量，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高、操作繁瑣而且很難實(shí)時(shí)反映胞內(nèi)c-di-GMP含量。為了解決這一問(wèn)題，我們利用c-di-GMP能夠作為核糖開(kāi)關(guān)配體分子調(diào)控基因表達(dá)原理構(gòu)建了c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)監(jiān)測(cè)模型并以此模型監(jiān)測(cè)

7、抗生素作用下細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平變化，從而確定抗生素是否通過(guò)第二信使調(diào)控細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)。首先，我們分別從霍亂弧菌VC16961、臘樣芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌基因組上克隆了六個(gè)c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch)基因。然后分別利用sacB和lacZ報(bào)告基因成功構(gòu)建了6組c-di-GMP含量變化體內(nèi)檢測(cè)模型。通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和功能驗(yàn)證，我們獲得了一個(gè)特異性強(qiáng)，靈敏度高的c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)生物檢測(cè)模型Ahy-1。利用此模型

8、我們檢測(cè)了亞抑菌濃度抗生素作用下紫色桿菌胞內(nèi)c-di-GMP含量變化，結(jié)果表明亞抑菌濃度抗生素下調(diào)了紫色桿菌胞內(nèi)c-di-GMP水平。由于c-di-GMP負(fù)調(diào)控紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，因此我們認(rèn)為亞抑菌濃度抗生素能通過(guò)c-di-GMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)紫色桿菌群體感應(yīng)行為。
　　綜上所述：本文我們發(fā)現(xiàn)并證明了亞抑菌濃度抗生素促進(jìn)紫色桿菌群體感應(yīng)發(fā)生，探究了c-di-GMP合成酶基因adrA轉(zhuǎn)入后對(duì)紫色桿菌群體感應(yīng)行為的調(diào)控，構(gòu)建并優(yōu)化了c