小鼠生殖細(xì)胞體外發(fā)育營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育是非常復(fù)雜的過(guò)程,受到多種激素、生長(zhǎng)因子以及外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控。植物性生物活性物質(zhì)人參皂甙(ginsenosides,GS)和大豆黃酮(daidzein,DAI)具有多種生物學(xué)功能,如抗氧化作用、雌激素樣作用以及提高繁殖性能等,因而成為當(dāng)前相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。然而,GS和DAI對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育的作用尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的小鼠A型精原細(xì)胞和卵母細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究GS和DAI對(duì)A型精原細(xì)胞增殖和卵母細(xì)

2、胞減數(shù)分裂成熟的作用并探討其機(jī)理,為植物性生物活性物質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用提供理論指導(dǎo)。
　　 1.小鼠A型精原細(xì)胞增殖的激素調(diào)控
　　 出生6天的ICR小鼠的睪丸組織用膠原酶分散成單個(gè)細(xì)胞,建立精原細(xì)胞-體細(xì)胞體外無(wú)血清共培養(yǎng)系統(tǒng)。經(jīng)c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定表明所分離和培養(yǎng)的生殖細(xì)胞為A型精原細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明添加了10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8 mol

3、/L亞硒酸鈉的DMEM培養(yǎng)液(ITS培養(yǎng)液)可維持A型精原細(xì)胞的存活和增殖。本實(shí)驗(yàn)利用所建立的培養(yǎng)模型研究了卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、睪酮(testosterone,T)和雌二醇(17β-estradiol,E2)對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖的影響,從而驗(yàn)證該培養(yǎng)模型在外源因素對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育影響研究上的適用性。EGF及

4、其受體(EGFR)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明EGF和EGFR主要表達(dá)于精原細(xì)胞。單獨(dú)的FSH(1～100 ng/ml)或EGF(1～10 ng/ml)顯著促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖。FSH(10 ng/ml)聯(lián)合EGF(0.1 ng/ml)具有加性效應(yīng),但與更高劑量的EGF(1～10 ng/ml)聯(lián)合處理則降低了FSFI的刺激作用。此外,T(10-3～10-6 mol/L)和E2(10-8～10-6 mol/L)均能促進(jìn)小鼠A型精原細(xì)胞體外增殖,雄激

5、素受體阻斷劑氟硝丁酰胺(flutamide.FLU)或雌激素受體阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen,TMX)可分別抑制T或E2的促增殖作用,這說(shuō)明T和E2是通過(guò)體細(xì)胞的介導(dǎo)而發(fā)揮其促進(jìn)精原細(xì)胞增殖的作用。以上結(jié)果表明生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型中的精原細(xì)胞對(duì)促性腺激素和性激素以及生長(zhǎng)因子具有較好的反應(yīng)性,FSH和T及E2可通過(guò)共培養(yǎng)模型中的體細(xì)胞分泌的旁分泌因子間接作用于生殖細(xì)胞,EGF直接作用于生殖細(xì)胞,從而促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖。這說(shuō)明本

6、實(shí)驗(yàn)建立的培養(yǎng)模型是一種評(píng)價(jià)A型精原細(xì)胞體外增殖調(diào)控的合適模型,并可用于哺乳動(dòng)物精原細(xì)胞發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究。
　　 2.人參皂甙對(duì)小鼠A型精原細(xì)胞增殖的影響
　　 利用精原細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)體系來(lái)評(píng)價(jià)GSX寸小鼠A型精原細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。精原細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,GS(1.O～10μg/ml)能夠顯著刺激A型精原細(xì)胞的增殖,精原細(xì)胞集落的數(shù)目和面積均顯著高于對(duì)照組。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的

7、激活劑佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA,10-8～10-7 mol/L)顯著促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖,這一作用可被PKC的抑制劑H7所抑制。此外,腺苷酸環(huán)化酶激活劑福司克林(forskolin,FSK,10-6～10-5 mol/L)也可刺激小鼠A型精原細(xì)胞的增殖,這一作用可被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制劑H89所抑制。這些結(jié)果表明PKA和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活均能促進(jìn)

8、A型精原細(xì)胞的增殖。此外,GS和PMA具有協(xié)同作用。H7可顯著抑制GS誘導(dǎo)的A型精原細(xì)胞的增殖。然而,H89對(duì)GS誘導(dǎo)的A型精原細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響,說(shuō)明GS的作用并不是通過(guò)PKA信號(hào)途徑介導(dǎo)的。以上的結(jié)果表明PKA和PKC信號(hào)通路在小鼠A型精原細(xì)胞的增殖過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用,GS可能通過(guò)PKC介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)小鼠A型精原細(xì)胞的增殖。
　　 3.大豆黃酮對(duì)多氯聯(lián)苯引起的小鼠睪丸生殖細(xì)胞損傷的緩解作用
　　 A型精

9、原細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈集落生長(zhǎng),而3周齡小鼠的生殖細(xì)胞呈單個(gè)生長(zhǎng),更利于散在細(xì)胞形態(tài)變化的觀察,因此,本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的小鼠睪丸生殖細(xì)胞研究了典型內(nèi)分泌干擾物多氯聯(lián)苯Aroclor1254(A1254)對(duì)生殖細(xì)胞損傷的機(jī)理,并探討了DAI對(duì)A1254引起的睪丸生殖細(xì)胞氧化損傷的緩解作用及其作用機(jī)制。DAI是一類廣泛分布在豆類植物中的多酚類化合物,具有抗氧化作用。多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是一

10、類難分解的氯代芳烴族環(huán)境污染物,對(duì)人和動(dòng)物的各種組織都有很強(qiáng)的毒性作用,特別易誘發(fā)發(fā)育異常和生殖系統(tǒng)的損傷。本實(shí)驗(yàn)用活性氧自由基產(chǎn)生系統(tǒng)次黃嘌呤(hypoxanthine,HX)/黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)DAI的抗氧化作用。結(jié)果表明,A1254(20～30μg/ml)以及HX/XO系統(tǒng)(10-5～mol/L;2.5×10-3 IU/ml)產(chǎn)生的活性氧對(duì)睪丸生殖細(xì)胞具有嚴(yán)重的損傷作用,導(dǎo)致細(xì)胞破裂,

11、存活的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。DAI(10μg/ml)可明顯緩解A1254或HX/XO系統(tǒng)引起的生殖細(xì)胞的氧化損傷,使存活的細(xì)胞數(shù)目顯著增加,并恢復(fù)A1254引起的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平的下降以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成的增加。結(jié)果說(shuō)明DAI具有抗氧化活性,能夠緩解A1254引起的生殖系統(tǒng)氧化損傷,因此DAI對(duì)于A125

12、4引起的生殖毒性具有重要的緩解作用。
　　 4.人參皂甙對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)利用小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)模型研究GS對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響,從而進(jìn)一步評(píng)價(jià)GS對(duì)生殖健康的作用。處于生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes,COC)和去卵丘的卵母細(xì)胞(denuded oocytes,DO)取自于性未成熟的ICR小鼠。生發(fā)泡破

13、裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第—極體(firstpolar body,PB1)排出的情況作為判斷卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的指標(biāo)。HX(4 mmol/L)可抑制卵母細(xì)胞的自發(fā)成熟。FSH能克服HX的抑制,顯著誘導(dǎo)COC恢復(fù)減數(shù)分裂成熟。以上的結(jié)果說(shuō)明HX維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的體外培養(yǎng)系統(tǒng)是能夠模擬體內(nèi)環(huán)境研究外源因素對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟影響的合適模型。本實(shí)驗(yàn)利用該培養(yǎng)模型研究了GS對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影

14、響,結(jié)果表明1.0～10μg/ml的GS可克服HX維持的減數(shù)分裂阻滯,促進(jìn)COC恢復(fù)減數(shù)分裂成熟,GVBD發(fā)生率和PB1排出率顯著提高,而GS對(duì)DO沒(méi)有作用。此外,GS(1.0μg/ml)和FSH(0.1 IU/ml)具有協(xié)同作用。TMX和Nω硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethyl ester,L-NAME,一種NO合酶抑制劑)被用來(lái)研究GS誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的機(jī)制。TMX對(duì)GS誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)

15、分裂無(wú)顯著影響,說(shuō)明GS并不是通過(guò)雌激素樣作用介導(dǎo)的。L-NAME(1 mmol/L)可顯著抑制GS誘導(dǎo)的減數(shù)分裂成熟,GVBD發(fā)生率和PB1排出率顯著低于GS處理組。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果也表明GS能增加卵丘細(xì)胞上誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá),L-NAME則可抑制GS引起的iNOS表達(dá)的增加。結(jié)果表明GS可能通過(guò)NO/iNOS體系以旁分泌的方式促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的

16、成熟。結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了小鼠雄性的A型精原細(xì)胞和雌性的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)添加胰島素、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白的ITS培養(yǎng)體系能夠很好地維持精原細(xì)胞的存活。多種生殖激素(FSH、T和E2)和生長(zhǎng)因子EGF均能夠促進(jìn)A型精原細(xì)胞的增殖。此外,PKA和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活也可促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖。GS通過(guò)PKC信號(hào)途徑促進(jìn)A型精原細(xì)胞的增殖。此外,植物性抗氧化劑DAI可以通過(guò)抗氧化活性緩解A1254引起的生殖細(xì)胞的氧化損傷