豬原始生殖細(xì)胞體內(nèi)跟蹤、體外培養(yǎng)及遺傳印記的研究.pdf

1、胚胎生殖細(xì)胞(EG)是從胎兒原始生殖細(xì)胞(PGCs)分離培養(yǎng)出來的具有發(fā)育多潛能性的一種多潛能干細(xì)胞。傳統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞(ES)多從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)獲得，如小鼠ES。但對(duì)大家畜而言，很難獲得充足的囊胚，ES建系也還沒有成功。自從PGCs來源的小鼠EG細(xì)胞建立后，通過檢測(cè)mEG的生物學(xué)特性和mES相似，使人們有理由相信，由其他物種的PGCs也同樣能夠獲得EG細(xì)胞。雖然關(guān)于豬EG細(xì)胞的獲得早有報(bào)道，但是，至今仍然未能建成與小鼠ES和E

2、G一樣穩(wěn)定的細(xì)胞系。原因是多方面的，一是我們對(duì)豬PGCs的發(fā)生、增殖、遷移等過程缺少了解;二是我們對(duì)豬PGCs的表觀遺傳學(xué)變化研究甚少;三是PGCs細(xì)胞體外培養(yǎng)體系仍有待完善。本研究選擇豬胚胎發(fā)育22天至30天的生殖嵴為研究對(duì)象，通過組織切片技術(shù)對(duì)生殖嵴形態(tài)及PGCs在體內(nèi)的遷移進(jìn)行了跟蹤;利用Realtime PCR及亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)印記基因的表達(dá)及甲基化水平進(jìn)行了分析;通過對(duì)不同胎齡、不同飼養(yǎng)層、不同的傳代方法的比較對(duì)類EG細(xì)胞

3、的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，期望在認(rèn)知豬PGCs體內(nèi)生物學(xué)變化規(guī)律的基礎(chǔ)上優(yōu)化體外培養(yǎng)條件，最終獲得穩(wěn)定傳代的豬EG細(xì)胞系。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)組織切片HE染色法跟蹤了豬生殖嵴形態(tài)變化。在胚胎發(fā)育的22天還沒有形成生殖嵴;24天，中腎內(nèi)側(cè)壁局部增厚;26天，已經(jīng)能夠看到明顯的兩條細(xì)長(zhǎng)的索狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn);28天，中腎內(nèi)側(cè)壁繼續(xù)增厚，生殖嵴變大，凸向體腔;30天，生殖嵴發(fā)育形成可以獨(dú)立分離的結(jié)構(gòu)，凸向體腔。
　　 (2)

4、Oct4、Stella及Fragilis三個(gè)生殖細(xì)胞特異標(biāo)記物對(duì)PGCs進(jìn)行了體內(nèi)跟蹤。胚齡22天，生殖嵴及附近沒有觀察到PGCs;24天，盡管中腎內(nèi)側(cè)壁增厚，但是也未發(fā)現(xiàn)PGCs;26天，可見少量PGCs進(jìn)入生殖嵴，但是大部分PGCs還在生殖嵴附近的腸系膜處;28天，PGCs大部分已經(jīng)進(jìn)入到生殖嵴;胚胎發(fā)育第30天時(shí)，PGCs幾乎全部進(jìn)入生殖嵴而且有聚集的趨勢(shì)。
　　 (3)通過Realtime PCR的方法，分析了印記基因I

5、gf2、H19、Xist、Peg3、Grb10、Diras3及Plag11在PGCs中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Igf2、H19及Diras3基因在22及24天的表達(dá)量明顯低于26天，Grb10在28天的表達(dá)量達(dá)到最高。雌性PGCs中Xist基因在30天時(shí)表達(dá)量明顯升高。
　　 (4)采用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法，分析了22-30天PGCs中Igf2和H19兩個(gè)印記基因的甲基化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在26天前二者DMR的甲基化呈逐漸降低的趨勢(shì)

6、，26天達(dá)到最低;之后，甲基化水平逐漸升高。Igf2和H19兩個(gè)印記基因在體外培養(yǎng)的類EG細(xì)胞中呈高甲基化狀態(tài)。
　　 (5)本研究分離了不同階段的PGCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，從胚胎發(fā)育24-28天的PGCs得到了類EG細(xì)胞，而在22和30天的胚胎中我們并沒有觀察到明顯的克隆形成。比較24、26和28天的細(xì)胞克隆數(shù)及傳代能力，26天的PGCs用于類EG培養(yǎng)具有優(yōu)勢(shì)。
　　 (6)本研究通過比較小鼠成纖維細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞及

7、豬性腺-中腎區(qū)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，在原代培養(yǎng)中，性腺-中腎區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)效果要好于其它兩種，而在傳代培養(yǎng)中，三者的差異并不顯著。最終采用與豬性腺-中腎區(qū)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法得到了類EG細(xì)胞，但所得的類EG細(xì)胞在體外最高傳至12代，并未建立穩(wěn)定的能夠體外長(zhǎng)期傳代的豬EG細(xì)胞系，說明我們的培養(yǎng)條件還是不夠理想，仍需繼續(xù)優(yōu)化。
　　 (7) Realtime PCR及免疫熒光檢測(cè)證明豬類EG細(xì)胞表達(dá)多能性基因Oct4、Sox2及N

8、anog;免疫熒光檢測(cè)證明其表達(dá)胚胎階段特異性抗原SSEA3和SSEA4; TRAP-PCR檢測(cè)表明豬類EG細(xì)胞具有端粒酶活性; Realtime PCR檢測(cè)證明EG細(xì)胞有Xist基因的表達(dá)。
　　 (8)本研究通過EG細(xì)胞延遲傳代自發(fā)分化得到了具有上皮樣、成纖維樣及神經(jīng)樣的細(xì)胞;通過EG細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)形成擬胚體，貼壁培養(yǎng)后能夠分化成具有三個(gè)不同胚層來源細(xì)胞特征的細(xì)胞，顯示得到的類EG細(xì)胞具有多向分化潛能。
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