雞胚胎原始生殖細(xì)胞建系能力的研究.pdf

1、胚胎原始生殖細(xì)胞(EmbryonicPrimordialGermCells，EPGCs)是生殖母細(xì)胞的前體細(xì)胞，是精子或卵子的祖先細(xì)胞，在多能干細(xì)胞研究領(lǐng)域中已成為一個(gè)新的干細(xì)胞資源，亦是近年來(lái)干細(xì)胞研究的又一個(gè)熱點(diǎn)。基于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)雞胚胎原始生殖細(xì)胞(EPGCs)正處于起步的研究現(xiàn)狀，本研究對(duì)這一胚胎生殖系干細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)的探索性研究。在雞胚發(fā)育的第14期血液中、第19期和第28期的生殖腺中采用不同的分離提取方法分別獲取EPGCs，并

2、進(jìn)行體外培養(yǎng)，以探討分離培養(yǎng)EPGCs的適宜時(shí)期和方法；系統(tǒng)地探索了EPGCs的體外培養(yǎng)體系、傳代方法和條件、不同冷凍體系對(duì)雞EPGCs冷凍保存的效果以及外源性細(xì)胞因子mLIF、hSCF、bFGF和hIL-11對(duì)體外培養(yǎng)的雞EPGCs增殖和分化的影響，以期篩選出雞EPGCs合適的體外培養(yǎng)體系和冷凍保存條件；同時(shí)利用不同特異性化學(xué)物質(zhì)定向誘導(dǎo)EPGCs向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，以及嘗試對(duì)EPGCs單細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)克隆傳代、檢測(cè)其形態(tài)

3、特征、表面標(biāo)記及體外分化等特征特性，為建立EPGCs干細(xì)胞系以及體外研究胚胎發(fā)育、基因組學(xué)研究、藥物篩選等提供有價(jià)值的參考依據(jù)。 研究結(jié)果主要?dú)w納為以下幾個(gè)方面： 1.采用Ficoll密度梯度離心法+酶解法、單獨(dú)EDTA-酶解法兩種方法，分別提取第14期血液(孵化53小時(shí))、第19期(孵化72小時(shí))和第28期(孵化132小時(shí))生殖腺中的雞EPGCs，比較在相同的體外培養(yǎng)條件下兩種分離方法獲取三個(gè)發(fā)育時(shí)期的雞EPGCs數(shù)量

4、、存活率和存活時(shí)間的差異。結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)EDTA-酶解法分離到的細(xì)胞總數(shù)(2.7×104/胚胎)極顯著地(P＜0.01)多于Ficoll密度梯度離心法+酶解法分離到細(xì)胞數(shù)量(1.8×104/胚胎)；單獨(dú)酶解離法獲得細(xì)胞存活率為89.5％，F(xiàn)icoll密度梯度離心法+酶解法獲得細(xì)胞存活率為87.5％，細(xì)胞存活率在兩種分離方法之間差異不顯著(P＞0.05)；將三個(gè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期所提取的EPGCs在不加任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯

5、示：第14期提取的EPGCs培養(yǎng)存活時(shí)間最短，在60～72h之間；第19期的最長(zhǎng)，在80～88h之間；第28期的介于兩者之間，存活時(shí)間為72～80h。三個(gè)時(shí)期所提取的EPGCs存活率差異顯著(P＜0.05)：在第19期和第28期生殖腺中提取的EPGCs存活率明顯高于第14期(P＜0.01)，但在第19期和第28期之間EPGCs存活率和存活時(shí)間差異不顯著(P＞0.05)。 2.將采用單獨(dú)酶解離法分離得到的第19期和第28期雞EPG

6、Cs接種到四種不同的培養(yǎng)體系中，比較在不同的培養(yǎng)體系中各種因素對(duì)EPGCs培養(yǎng)傳代的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在無(wú)飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中不添加外源性細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系1中，無(wú)EPGCs的AKP陽(yáng)性克隆形成；在無(wú)飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子培養(yǎng)體系2中，培養(yǎng)72h后有一代EPGCs的AKP陽(yáng)性克隆形成，克隆形成率為33.33％，但EPGCs在傳代后不能重新聚集形成集落；在以雞胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中不添加外源性細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系3中，培養(yǎng)48

7、h后可見細(xì)胞成集落狀隆起生長(zhǎng)，但傳至三代后未觀察到EPGCs集落形成，第一代和二代EPGCsAKP陽(yáng)性克隆形成率分別為40％和20％。與其它三個(gè)培養(yǎng)體系相比，將EPGCs接種雞胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中添加10％的胎牛血清、2％的雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitory

8、factor，mLIF)、5ng/ml人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Humanstemcellfactor，hSCF)、10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Fibroblastgrowthfactor-basic，bFGF)、0.04ng/ml人白細(xì)胞介素-11(Humaninterleukin-11，hIL-11)，10ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子(Humaninsulin-likegrowthfactor，hIGF)的高糖DMEM培養(yǎng)體系4中培養(yǎng)，

9、培養(yǎng)約2～3d時(shí)開始出現(xiàn)鳥巢狀的EPGCs集落，以多次離散法進(jìn)行傳代獲得了五代EPGCs的AKP陽(yáng)性克隆，1～5代EPGCs克隆形成率分別為80％、66.67％、46.67％、26.67％和13.33％，與其它三個(gè)培養(yǎng)體系中AKP陽(yáng)性克隆形成率存在極顯著差異(P＜0.01)。 3.采用二甲基亞砜、乙二醇、聚乙二醇為冷凍保護(hù)劑，對(duì)發(fā)育至第19期和第28期雞EPGCs，采用不同的冷凍保護(hù)劑以及不同的組合，在同一種冷凍程序下進(jìn)行超低溫

10、冷凍保存。結(jié)果表明：當(dāng)冷凍保護(hù)劑濃度為10％時(shí)，對(duì)于分離后直接進(jìn)行冷凍保存的EPGCs，冷凍保護(hù)劑Ⅳ(5％DMSO+5％乙二醇+20％胎牛血清+70％DMEM)的凍存效果最好，EPGCs的存活率分別為90.56％和91.23％，極顯著優(yōu)于其它冷凍保護(hù)劑的凍存保護(hù)效果(P＜0.01)。對(duì)于傳代培養(yǎng)后再進(jìn)行冷凍保存的EPGCs，冷凍保護(hù)液Ⅳ(5％DMSO+5％乙二醇+20％胎牛血清+70％DMEM)和Ⅵ(5％聚乙二醇+5％DMSO+20％胎

11、牛血清+70％DMEM)的保護(hù)效果最好。 4.采用MTT法分別檢測(cè)mLIF、bFGF、hSCF、hIL-11四種細(xì)胞因子在單獨(dú)添加和聯(lián)合使用時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)條件下的第19期和第28期的雞EPGCs生長(zhǎng)增殖的影響。結(jié)果表明：由于在一定范圍內(nèi)細(xì)胞增殖情況與OD值呈線形關(guān)系，當(dāng)四種細(xì)胞因子在分別單獨(dú)添加時(shí)，加入mLIF后48h、72h、120h，5ng/ml和10ng/ml劑量組對(duì)EPGCs的增殖效應(yīng)最明顯，OD均值分別為0.3651、0

12、.4313、0.5008和0.3473、0.4083、0.4410，而未添加細(xì)胞因子的對(duì)照組OD均值為0.1382，與15ng/ml、20ng/ml和25ng/ml實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組比較存在顯著的差異(P＜0.05)。在加入hSCF后48h、72h，各實(shí)驗(yàn)組5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml和20ng/ml增殖效應(yīng)與對(duì)照組比較均存在顯著性差異(P＜0.05)，OD均值分別為0.2975、0.2808、0.2691、

13、0.2629、0.2834和0.2588、0.2437、0.3448、0.2600、0.2233；加入hSCF后120h，5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和25ng/ml實(shí)驗(yàn)組的增殖效應(yīng)與對(duì)照組比較差異不顯著(P＞0.05)，15ng/ml組的增殖效應(yīng)與對(duì)照組比較存在顯著性差異(P＜0.05)，其OD均值為0.295，未添加細(xì)胞因子對(duì)照組OD均值為0.17。加入bFGF后48h、72h、120h，5ng/ml、10ng/ml

14、、15ng/ml、20ng/ml和25ng/ml增殖效應(yīng)與對(duì)照組比較均存在顯著性差異(P＜0。05)，OD均值分別為0.24075、0.22183、0.22456、0.26992、0.20392；0.24408、0.22758、0.23717、0.31208、0.31425和0.22683、0.22658、0.24883、0.26175、0.27258，而對(duì)照組的OD均值為0.163，其中20ng/ml組與對(duì)照組比較差異極顯著(P＜0.

15、01)。加入hIL-11后48h，0.05ng/ml劑量組的增殖效應(yīng)顯著高于其它各組(P＜0.05)，0D均值為0.26992；加入hIL-11后72h、120h，0.05ng/ml、0.10ng/ml劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)OD均值分別為0.26183、0.23398和0.2465、0.2355，而對(duì)照組的OD均值為0.179333。四因子聯(lián)合使用時(shí)，hIL-11的劑量0.01～0.20ng/ml之間時(shí)OD均值有隨劑

16、量增高而上升的趨勢(shì)，當(dāng)劑量為0.20ng/ml時(shí)，其OD值呈降低趨勢(shì)，推斷hIL-11的最佳作用劑量是0.10～0.20ng/ml。 5.利用特異性的化學(xué)物質(zhì)地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)定向誘導(dǎo)第19期和第28期的雞EPGCs向脂肪細(xì)胞分化，油紅O特異性染色鑒定。結(jié)果顯示：EPGCs被誘導(dǎo)14～21d后，分化成脂肪細(xì)胞，陽(yáng)性率平均為75～90％，其中先使用誘導(dǎo)劑Ⅱ(地塞米松+胰島素+IBMX)再加入誘

17、導(dǎo)劑Ⅲ(胰島素)的誘導(dǎo)分化效果最好，第19期和第28期EPGCs誘導(dǎo)分化率分別為89％和91％，與誘導(dǎo)劑Ⅰ(地塞米松+胰島素)和Ⅱ(IBMX)相比較差異極顯著(P＜0.01)，誘導(dǎo)劑Ⅰ和Ⅱ的誘導(dǎo)分化率分別為76％和78％，76％和74％。在使用同一種誘導(dǎo)劑的情況下，第19期和第28期兩個(gè)時(shí)期EPGCs誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化率差異不顯著(P＞0.05)。 6.首次嘗試對(duì)雞EPGCs進(jìn)行單細(xì)胞克隆體外培養(yǎng)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。對(duì)獲