fecl3溶液誘導(dǎo)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

1、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)2016，53(1)：149—155XinjiangAgriculturalSciencesdoi：106048／jissn1001—4330201601020FeCl3溶液誘導(dǎo)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系李月榮1，李榮飛1，張波17，李迪迪1，王曉琴1(1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002；2省部共建新疆特種資源植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832002)摘要：【目的】研究葡萄白藜蘆醇的誘導(dǎo)劑，為開發(fā)新

2、的葡萄保鮮劑與農(nóng)藥提供參考。【方法】采用FeEl，水溶液對紅地球葡萄葉片愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，應(yīng)用HPLC分析愈傷組織中自藜蘆醇的含量變化，DAB染色法檢測活性氧水平，使用RT—PCR方法分析芪合酶基因(sis)的表達(dá)量變化。【結(jié)果】FeEl，溶液對葡萄愈傷組織芪類物質(zhì)具有顯著的誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)白藜蘆醇的積累呈現(xiàn)顯著的量時(shí)依賴性；16mMFeEl，溶液處理18h后愈傷組織中白藜蘆醇含量可提高約85倍，鮮重達(dá)到2108r。g／s。FeCl3溶液

3、處理組的活性氧水平均高于對照組；加抗氧化劑CAT和NAC可明顯降低FeEl，對白藜蘆醇誘導(dǎo)效果。【結(jié)論】FeCl3溶液對紅地球葡萄葉愈傷組織白藜蘆醇積累具有顯著升高作用，其積累機(jī)制與FeEl，所導(dǎo)致的氧脅迫正相關(guān)。關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；FeEl，溶液；愈傷組織；氧化應(yīng)激中圖分類號(hào)：$6631；S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1001—4330(2016J0l—0149一070引言【研究意義】白藜蘆醇(Resveratrol，縮寫Res)又稱

4、芪三酚，存在于葡萄、虎杖、桑葚、花生等植物中，是一種植保素。葡萄葉片中自藜蘆醇含量較低，僅為O06—46斗g／g鮮重，作為植保素，葡萄在真菌感染、干旱、鹽堿或其他氧化脅迫條件下白藜蘆醇含量會(huì)升高?？梢曰谝陨涎芯砍晒麑ふ乙环N有效、綠色、廉價(jià)的誘導(dǎo)劑用于葡萄植株的病害預(yù)防或葡萄的保存?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已有報(bào)道可以升高葡萄材料白藜蘆醇的非生物誘導(dǎo)劑有UV【1—3。、C02‘41、臭氧‘51、H202[61、乙磷鋁‘71、氯化鋁㈨、CuS

5、O。[9l、茉莉酸甲酯㈨、水楊酸1】等，同時(shí)也有研究報(bào)道表面活性劑SDS、TX—100可顯著增加H：0：的誘導(dǎo)作用2|。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片材料白藜蘆醇含量與其所處氧化脅迫狀態(tài)密切相關(guān)B’13l，但葉片材料對液體誘導(dǎo)劑吸收相對局限，所用誘導(dǎo)劑如鋁劑毒性過大，限制了其在果實(shí)保藏上的應(yīng)用?，F(xiàn)有的植物營養(yǎng)元素中，在滴水觀音的營養(yǎng)液中加入過量的FeCI，溶液之后，會(huì)對滴水觀音造成有效的氧化脅迫[14|。FeCl，又屬于低毒性的化學(xué)試劑，

6、而葡萄愈傷組織所處環(huán)境易控制，底物含量低等，研究鐵劑對葡萄葉片愈傷組織的誘導(dǎo)更有意義?！颈狙芯壳腥它c(diǎn)】前人研究已表明FeCl，溶液可以對某些植物造成氧化脅迫，而對于葡萄來說，氧化脅迫是一種有效升高其白藜蘆醇含量的方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以紅地球葡萄葉片愈傷組織為材料，研究FeCI，溶液是否會(huì)對葡萄愈傷造成氧化脅迫，從而使白藜蘆醇含量升高。1材料與方法11材料111紅地球葡萄紅地球葡萄(VitisviniferaLevRedGlobe)

7、由新疆石河子葡萄研究所提供，于石河子大學(xué)藥收稿日期：2015—06—30基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160058)；新疆兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014BA029)作者簡介：李月榮(1990一)，IⅡllll威遠(yuǎn)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)制藥，(E—marl)yueronger512@163corn通訊作者：張波(1978一)，陜西寶雞人，教授，博士，研究方向?yàn)槟[瘤藥理及生物技術(shù)制藥，(E—mail)Bozhang_I

8、zu@126COS萬方數(shù)據(jù)1期李月榮等：FeCl，溶液誘導(dǎo)葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系151△OD3如=OD對照組一OD實(shí)驗(yàn)組。124白藜蘆醉的提取和檢測將稱重后的愈傷組織加適量甲醇，研磨，超聲提取20min，然后振蕩離心，提取三次，再將上清液收集蒸干，干樣品溶解于甲醇溶液中，用甲醇定容至10mL容量瓶中。通過HPLC法對葡萄葉片中的白藜蘆醇進(jìn)行定量分析，方法參照文獻(xiàn)u3|。上述操作均在避光條件下進(jìn)行。用島津Essent

9、iaLC一15C高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)檢測：將制備的樣品(10000g)離心10min，取上清液過有機(jī)膜(045燦m)，02％磷酸水過水膜(O45岬)。色譜條件：采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為雙蒸水(02％磷酸)，柱溫25℃，進(jìn)樣量20斗L，流速1mL／min，檢測波長306nm。色譜柱AtlantisC18(250mm46mm，5pan，Waters公司)。洗脫程序：O～4min，80％～76％B；4—20r

10、ain，76％一69％B；20—25min，69％～60％B。每個(gè)樣品重復(fù)3次。白藜蘆醇含量采用(斗g／g鮮重)表示。125白藜蘆醇芪舍酶基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測根據(jù)實(shí)驗(yàn)的量效和時(shí)效關(guān)系分別選取0、O8、16和24mM的FeCl3溶液處理葡萄愈傷組織18h，用RNApmpPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA(天根生化科技有限公司，北京)，參考方法叫；eDNA第一條鏈合成根據(jù)(RevertAidFirstStrandeDN

11、ASynthesisKit，美國Fermentas公司)推薦方法n引進(jìn)行；根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)葡萄白藜蘆醇合成途徑關(guān)鍵酶芪合酶(STS)基因引物‘馴，內(nèi)參18SrRNA基因‘2，實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照(QuantiFastSYBRGreenPCRKit，QIAGEN)說明書方法進(jìn)行。表113數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差(MeanvaluesS)表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較。表2引物序列引物縮寫登錄號(hào)引

12、物序列分子量(KD)2結(jié)果與分析21FeCl3溶液對葡萄愈傷組織白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用研究表明，隨著FeCI。溶液濃度的增加，其葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量明顯升高；且16mMFeCl3處理組其含量達(dá)到最大，為2108t_Ls／s鮮重；20mMFeCl，溶液處理組含量有所下降但仍整體高于空白組。通過16mMFeCl，溶液處理不同時(shí)間后測定愈傷組織中自藜蘆醇的變化，發(fā)現(xiàn)隨著FeCI，溶液暗孵育時(shí)間的增加，白藜蘆醇的誘導(dǎo)量先增加后降低，在18h時(shí)