甲磺酸去鐵胺對“Ⅰ型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”干預(yù)及部分機(jī)制的實驗觀察.pdf

1、第一部分甲磺酸去鐵胺對小鼠“Ⅰ型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”干預(yù)后骨量變化
　　目的：本研究旨在探討鐵螯合劑甲磺酸去鐵胺（DFO）對去勢后枸櫞酸鐵銨（FAC）干預(yù)的雌性小鼠（模擬“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥小鼠模型”）骨量的影響，為“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”探索新的治療方案。
　　方法:選取2月齡C57BL/6雌性小鼠24只，隨機(jī)分為去勢（OVX）組、去勢+鐵劑干預(yù)組（OVX+Fe組）、去勢+鐵劑+去鐵胺組（OVX+Fe+DFO組）。三組均行

2、雙側(cè)卵巢切除術(shù)，后兩組在去勢后一周采用0.12g/kg/w的枸櫞酸鐵銨干預(yù)6周，干預(yù)方法為腹腔注射，每周干預(yù)三次，OVX組采用同樣方式和頻次的生理鹽水干預(yù)。隨后OVX+Fe+DFO組采用4000mg/kg/w的DFO干預(yù)2周，干預(yù)方法為腹腔注射，一日兩次，其他兩組給予同樣方式和頻次的生理鹽水干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后處死小鼠，在處死小鼠的前10天及前3天給小鼠腹腔注射鈣黃綠素。處死小鼠后分離雙側(cè)小鼠股骨，HE染色及微計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（Micro

3、-CT）觀察股骨遠(yuǎn)端微結(jié)構(gòu)，鈣黃綠素標(biāo)記骨形成速率，普魯士藍(lán)染色觀察股骨局部鐵蓄積，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）檢測骨組織骨保護(hù)素（OPG）、核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測小鼠血清鐵蛋白、OPG和RANKL水平。
　　結(jié)果:血清鐵蛋白水平方面，OVX+Fe組（408.90±17.20μg/ml）明顯高于 OVX組（87.53±3.73μg/ml）和O

4、VX+Fe+DFO組（162.30±10.58μg/ml）（P<0.05）。普魯士藍(lán)染色顯示股骨鐵蓄積 OVX組

5、e組比OVX組兩次標(biāo)記線之間的間隔短，MAR小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；OVX+Fe+DFO組比OVX+Fe組兩次標(biāo)記間的間隔長，MAR較大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；OVX+Fe+DFO組比OVX組標(biāo)記間的間隔短，MAR小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。OVX+Fe組（0.75±0.15）骨組織對OPG基因表達(dá)水平低于OVX組（1±0.2）和OVX+Fe+DFO組（0.89±0.15）（P<0.05），OVX+F

6、e組（2.2±0.12）骨組織對 RANKL基因表達(dá)水平高于 OVX組（1±0.13）和OVX+Fe+DFO組（1.3±0.2）（P<0.05），OVX+Fe組（2.8±0.4）骨組織對基因RANKL/OPG的表達(dá)比值高于OVX組（1±0.5）和OVX+Fe+DFO組（1.4±0.3）（P<0.05）。OVX+Fe組（1.22±0.18 ug/L）血清OPG含量低于OVX組（2.33±0.33 ug/L）和OVX+Fe+DFO組（2.1

7、8±0.25 ug/L）（P<0.05），OVX+Fe組（484.30±22.87 ng/L）血清RANKL含量高于OVX組（216.40±21.18 ng/L）和OVX+Fe+DFO組（289.70±20.76 ng/L）（P<0.05）。
　　結(jié)論：DFO對“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”小鼠模型的骨量有恢復(fù)作用，DFO的干預(yù)作用與成骨和破骨功能都有關(guān)聯(lián)。
　　第二部分含鐵環(huán)境中原代成骨細(xì)胞在甲磺酸去鐵胺（DFO）干預(yù)后的生物活

8、性變化及機(jī)制研究
　　目的：研究甲磺酸去鐵胺(DFO)對于含鐵環(huán)境原代成骨細(xì)胞（FAC干預(yù)）活性的影響，并探究其可能的機(jī)制。
　　方法：通過顱骨酶消化法從C57BL/6小鼠出生三天內(nèi)胎鼠的顱蓋骨分離原代成骨細(xì)胞（Osteoblast，OB），進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、堿性磷酸酶染色鑒定后，傳代培養(yǎng)至第三代。用CCK8法分別確定FAC及DFO的干預(yù)濃度后，分為3組:對照組，50uM/LFe（FAC）干預(yù)組，F(xiàn)e+DFO組（50uM

9、/LFe干預(yù)同時加入20uM/LDFO）。干預(yù)后三組細(xì)胞分別行堿性磷酸酶染色和活性定量，茜素紅染色和結(jié)節(jié)計數(shù)，對相關(guān)基因（Runx2，Sp7，Bglap，Axin2，OPG，Sod1）進(jìn)行定量PCR檢測其mRNA的表達(dá)水平,DCFH熒光探針分析各組活性氧水平。將50uM/LFe（FAC）干預(yù)的原代成骨細(xì)胞，分為四組，分別用0，5，10，20 uM/LDFO干預(yù)后，行茜素紅染色并計數(shù)，DCFH熒光探針分析各組活性氧水平，Westernbl

10、ot檢測 Axin2蛋白表達(dá)水平。再將原代成骨細(xì)胞分為4組，分別為對照組，50uM/LFe干預(yù)組，F(xiàn)e+DFO組（50uM/LFe干預(yù)同時加入20uM/LDFO），F(xiàn)e+DFO+DKK-1組（50uM/LFe干預(yù)同時加入20uM/LDFO+500ng/mlDKK-1），用DCFH熒光探針分析各組活性氧水平，Westernblot檢測Axin2及OPG蛋白表達(dá)水平，用茜素紅染色檢測其礦化能力。
　　結(jié)果：CCK8結(jié)果顯示，F(xiàn)e50u

11、M/L，DFO20uM/L干預(yù)，不影響細(xì)胞活性，各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與對照組相比，F(xiàn)e劑干預(yù)組，成骨相關(guān)基因Runx2，Sp7，Bglap，Axin2，OPG表達(dá)下降，而氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)Sod1表達(dá)上升，而Fe+DFO干預(yù)組與Fe干預(yù)組相比成骨相關(guān)基因表達(dá)上升，氧化應(yīng)激指標(biāo)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。ALP染色及活性定量定量和茜素紅染色及結(jié)節(jié)計數(shù)與對照組相比，F(xiàn)e組下降，而Fe+DFO組比Fe組上升，差異

12、有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。DCFH熒光顯示活性氧水平，F(xiàn)e組明顯高于對照組，F(xiàn)e+DFO組低于 Fe組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對50uM/LFe（FAC）干預(yù)的原代成骨細(xì)胞分別行0，5，10，20uM/LDFO干預(yù)。茜素紅染色及結(jié)節(jié)計數(shù)顯示隨著 DFO濃度增加，結(jié)節(jié)數(shù)量增加；Westernblot顯示Axin2蛋白表達(dá)水平隨著DFO濃度增加而增加；DCFH熒光顯示隨著DFO濃度上升，活性氧水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（

13、P<0.05）。使用DKK-1干預(yù)后，DCFH熒光顯示 Fe+DFO+DKK-1組和 Fe+DFO組活性氧水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；Westernblot顯示OPG及Axin2蛋白表達(dá)水平Fe+DFO+DKK-1組低于Fe+DFO組；茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)計數(shù)顯示Fe+DFO+DKK-1組少于Fe+DFO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：在含鐵環(huán)境中，原代成骨細(xì)胞成骨生物學(xué)活性抑制、骨相關(guān)基因的表達(dá)降低，原因可