基于分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、微生物是廢水處理、城市生活垃圾填埋或堆肥處理等系統(tǒng)中的主要功能生物，充分認(rèn)識其中的微生物學(xué)原理能為改進(jìn)處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)；此外，污染環(huán)境的土著微生物也是污染自凈的重要作用者，深入了解其存在狀況可以為這些污染環(huán)境的原位或異地恢復(fù)提供有力的微生物學(xué)根據(jù)。但是，目前研究環(huán)境微生物群落的主要方法仍是基于培養(yǎng)和分離純化的傳統(tǒng)技術(shù)，已經(jīng)無法滿足研究者對環(huán)境微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析與鑒定的要求。利用基于16S rRNA/rDNA序列分析

2、的分予生態(tài)學(xué)技術(shù)，研究者可以在不對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)的情況下對其進(jìn)行研究，甚至還可以利用原位核酸雜交和原位PCR技術(shù)對特定環(huán)境中的微生物進(jìn)行原位分析鑒定，并對微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，結(jié)果快速、準(zhǔn)確。 本文提出和改進(jìn)了溶菌酶法、超聲波破碎法和蛋白酶K-CTAB法等3種方法從環(huán)境樣品(本論文中以復(fù)雜的堆肥為例)直接提取微生物DNA，細(xì)胞直接計數(shù)表明三種方法對細(xì)胞的破碎效率均達(dá)到了94％以上，分光光度法檢測表明純化后的DNA

3、中腐殖酸濃度低于20 ng/μl，A<,260/280>值為1.7～1.8，使用16S rDNA引物對27F/1495R和GC341F/907R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到了特異性很強的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行的限制性片段長度多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳分析都表明，3種方法提取的DNA中有一致的微生物遺傳多樣性，因而能夠應(yīng)用于環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)研究。 為了初步了解堆肥中的細(xì)菌群落及其動態(tài)變化情況，使用餐廚垃圾進(jìn)行為期18天的小

4、規(guī)模堆肥，高溫階段(溫度高于50℃)共7天，最高溫度達(dá)到65℃，使用蛋白酶K-CTAB法從偶數(shù)天和高溫階段堆肥樣品中提取總DNA，并使用16SrDNA引物對GC341F/907R進(jìn)行PCR-DGGE分析，結(jié)合統(tǒng)計分析、條帶測序和系統(tǒng)發(fā)育分析對其中的細(xì)菌進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究。結(jié)果表明隨溫度升高，堆肥中細(xì)菌多樣性下降，不同時期的優(yōu)勢菌群不同，高溫階段細(xì)菌種群以嗜熱的芽孢桿菌屬細(xì)菌為主。 同時，采用自主設(shè)計的SBBR反應(yīng)器處理氨氮濃度

5、含量較高的垃圾填埋場滲濾液并對其細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和脫氮機(jī)理進(jìn)行分析。在保持(32±0.4)℃的環(huán)境溫度下，經(jīng)過58d的馴化和33d的穩(wěn)定，SBBR反應(yīng)器的脫氮效率最高達(dá)到95％。實驗結(jié)果表明，高頻間歇式曝氣方式在抑制了硝酸細(xì)菌的活性的同時也消除了亞硝酸鹽濃度和pH大幅波動對亞硝酸細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌活性的影響；在曝氣階段，溶解氧濃度被控制在1.2～1.4 mg.L<'-1>，亞硝酸細(xì)菌成為主體細(xì)菌，亞硝酸鹽積累；在缺氧階段，厭氧氨氧化細(xì)菌

6、成為主體細(xì)菌，曝氣階段積累的亞硝酸鹽與氨氮同時被去除。為了研究序批式生物膜反應(yīng)器中脫氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、種群變化及主要生物脫氮途徑情況，使用統(tǒng)計分析、16S rDNA克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育分析對生物膜細(xì)菌進(jìn)行分予生態(tài)學(xué)研究。結(jié)果表明，載體上形成了種群比較豐富、群落結(jié)構(gòu)與功能比較穩(wěn)定的生物膜，其中包括好氧反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌、大量的硝化細(xì)菌和厭氧反硝化細(xì)菌；在運行過程中的不同周期和單個周期的不同時刻，細(xì)菌群落組成都沒有發(fā)生明顯的變化；馴化

7、的生物膜中的細(xì)菌可能主要來自于滲濾液，而用于接種的常規(guī)污水處理廠污泥對脫氮生物膜的形成貢獻(xiàn)可能并不大。亞硝化-厭氧氨氧化-反硝化途徑是反應(yīng)器主要的脫氮途徑，通過該途徑去除的NH<,4><'+>-N占總?cè)コ康?5％以上；另外2條途徑則分別是亞硝化-反硝化途徑以及全程硝化-反硝化途徑。所有途徑都采取同步和分步2種方式完成，同步方式以曝氣階段的氮素虧損形式予以表現(xiàn)。分步方式則依靠各種脫氮微生物在曝氣階段和厭氧階段不同的活性程度完成。

8、 另外，為進(jìn)一步控制反應(yīng)器運行成本，在3種不同的低溫馴化策略下肩動3套規(guī)格相同的厭氧序批式生物膜反應(yīng)器(ASBBR)，在對運行過程中氮素變化規(guī)律進(jìn)行分析的同時，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對生物膜上的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步考察了厭氧氨氧化的活性．結(jié)果表明，對應(yīng)a1、a2和a3 3種不同的低溫馴化策略，A1、A2和A33個反應(yīng)器分別經(jīng)過62、56、70d的馴化后表現(xiàn)出不同的厭氧氨氧化活性。以氮素轉(zhuǎn)化效率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，其活性依