分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物群落與功能基因中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著工業(yè)的發(fā)展，人類活動對全球環(huán)境變化的影響越來越大。當(dāng)今世界三大環(huán)境問題:空氣中CO2含量逐漸升高、氮沉積效應(yīng)和生物多樣性下降，都與人類活動有著密切的關(guān)系。通過與美國俄克拉荷馬大學(xué)周集中教授的合作，本文首先通過環(huán)境微生物對全球氮沉積問題進行了初步的研究。然后對礦山的環(huán)境污染問題--酸性礦山廢水中的環(huán)境微生物進行了研究。環(huán)境樣品中微生物的多樣性和復(fù)雜性，促使人們不斷地嘗試使用新的研究方法和技術(shù)。在本文中，運用分子生態(tài)學(xué)中的功能基因芯片(

2、functionalgenearrays，F(xiàn)GAs)和限制片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)技術(shù)對環(huán)境微生物群落和功能基因進行了研究。
　　 (1)采用對土壤施加氮肥的方式模擬氮沉積對植物和微生物的影響。從美國明尼蘇達大學(xué)的CedarCreek生態(tài)科學(xué)研究保留地BioCON試驗田取得24個樣品，12個樣品經(jīng)過施加氮肥的處理，12個樣品沒有施加氮肥。通過對24個樣

3、品的基因組DNA提取和功能基因芯片技術(shù)分析后，發(fā)現(xiàn)氮肥的施用對土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和植物生長產(chǎn)生了顯著的影響。施加氮肥使得采樣點的植物地上部分的生物量增加，同時使得植物的地下根部的生物量減少;施加氮肥后，還使得土壤中微生物群落多樣性下降。
　　 (2)從百分比上來看，參與碳循環(huán)、氮循環(huán)、硫循環(huán)、磷循環(huán)、抗生素、金屬抗性、能量代謝和有機物修復(fù)的八大類功能基因在施加氮肥和未施加氮肥的樣品中百分比相似，沒有顯著的差異性。從數(shù)量上看，八

4、大類功能基因的數(shù)量在施加氮肥的樣品中比未施加氮肥的樣品少。對參與碳循環(huán)、氮循環(huán)、硫循環(huán)和磷循環(huán)的功能基因分析后發(fā)現(xiàn)，在施加氮肥的樣品中參與碳循環(huán)、氮循環(huán)、硫循環(huán)和磷循環(huán)的大部分功能基因豐度下降，而且這種差異很顯著;同時還對參與氮循環(huán)作用的關(guān)鍵功能基因進行了詳細地分析。
　　 (3)研究了13個外界因子與24個樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其中七個外界因子在改變樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)中可能起到了關(guān)鍵作用。這七個外界因素為:土壤

5、中氮含量(％)，土壤C/N比，地上C/N比，土壤中氮含量(g/m2)，地上氮含量(g/m2)，pH值，和濕度(0-20cm)。對13個外界因子和24個樣品的功能基因芯片數(shù)據(jù)進行了VPA分析，結(jié)果表明:“Environmentalfactors”部分能夠獨立解釋樣品之間44.37％的差異;“Plantbiomass”部分能夠獨立解釋樣品之間8.21％的差異;“Environmentalfactors”和“Plantbiomass”的重疊部

6、分能夠解釋樣品之間0.05％的差異;由于土壤樣品的復(fù)雜性，樣品之間的差異還有47.37％不能被解釋。
　　 (4)針對BioCON試驗田2005年的四個樣品和2009年的四個樣品，研究了施加氮肥時間長短對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因的影響。經(jīng)DCA分析發(fā)現(xiàn)不同氮肥施加時間對土壤樣品中的微生物群落產(chǎn)生了顯著影響，05年樣品與09年樣品被很好分開。Shannon多樣性指數(shù)分析、Simpson多樣性指數(shù)分析和八個樣品中檢測到的功能基因

7、數(shù)目，均說明隨著施加氮肥時間的延長，樣品中微生物群落的多樣性可能呈現(xiàn)上升的趨勢。
　　 (5)在05和09年的八個樣品中，通過對參與碳、氮、硫和磷循環(huán)的功能基因的豐度情況分析，結(jié)果表明大部分的參與碳、氮、硫和磷循環(huán)的基因在09年的樣品中的豐度比05年的樣品中的豐度高;但由于t測試得出的P值一般都在0.1以上，說明這種差異不是很顯著。
　　 (6)通過RFLP技術(shù)對廣東云浮硫鐵礦的兩個酸性礦坑水樣品中細菌群落進行了分析，結(jié)

8、果表明兩個酸性礦山廢水樣品(G1和G2)中細菌群落結(jié)構(gòu)存在很大的差異;樣品G2中細菌的多樣性要比樣品G1中的細菌多樣性大。在兩個樣品中總共檢測到15種細菌，這15種細菌根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果被歸分為4類，即Nitrospira綱，Alphaproteobacteria綱，Betaproteobacteria綱和Gammaproteobacteria綱的細菌。在這兩個酸性礦坑水樣品中主要存在的細菌是Gammaproteobacteria綱A

9、cidithiobacillus屬和Betaproteobacteria綱的細菌。
　　 (7)通過對兩個酸性礦山廢水樣品中得到的單克隆子進行測序、并與網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫進行比對分析，在樣品G1中得到2條未知的細菌16SrDNA基因序列;在樣品G2中得到到8條未知的細菌16SrDNA基因序列。這些新的序列，很可能代表著酸性礦山廢水中新的微生物。另外，結(jié)合兩礦山廢水樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)及29個元素含量分析的結(jié)果，表明礦山廢水樣品中元素A