pcr技術(shù)的基本原理

1、PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動(dòng)合成，通過一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5→3方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR目錄〔PCR原理〕PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條

2、件〔PCR步驟〕〔PCR檢測(cè)〕〔PCR反應(yīng)特點(diǎn)〕[PCR儀器]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變

3、性因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱Taqpolymerase)則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于19

4、83由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的，Dr.Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。[編輯本段]〔PCR原理〕DN

5、A的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅

6、操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至9

7、3℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=1012)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出

8、一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性退火延伸反應(yīng)，一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液

9、、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。〔PCR的循環(huán)參數(shù)〕1、預(yù)變性（Initialdenaturation）模板DNA完全變性對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，一般95℃加熱35分鐘。2、引物退火（Primerannealing）退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定。4、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使

10、各種靶DNA序列完全變性：變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含2535循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。6、最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持515分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。（四）PCR中的污染和假陽性PCR中污染主要來自1、樣品間交叉污染；2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carryover）[編輯本段][PCR儀器]pcr儀器的發(fā)展pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)