rpn4的生理功能及其降解研究

1、RPN4的生理功能及其降解研究的生理功能及其降解研究【摘要】：泛素蛋白酶體降解系統(tǒng)一直是胞內(nèi)用來(lái)清除異常的蛋白質(zhì)和選擇性降解各種生化過(guò)程中調(diào)控蛋白的執(zhí)行者，它可以降解錯(cuò)誤折疊的蛋白也可以及時(shí)更新細(xì)胞周期過(guò)程中的調(diào)控因子，對(duì)細(xì)胞的各種生化過(guò)程進(jìn)行精密的調(diào)節(jié)，從而可以將胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量維持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平，保證正常生命活動(dòng)的規(guī)律性。芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase4)基因，亦稱SON1和UFD

2、5，最開(kāi)始是作為溫度敏感株的抑制子Suppress被發(fā)現(xiàn)的，即PRN4的失活突變可以恢復(fù)sec63101在限制溫度下的生長(zhǎng)缺陷。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，RPN4基因的突變還可以穩(wěn)定泛素融合底物(UFDpathway的底物)UBVβgal，在不影響其多聚泛素化的情況下，阻礙26S蛋白酶體對(duì)它的降解，因此亦被命名為UFD5。以前的研究表明在蛋白酶體的32個(gè)亞基中有26個(gè)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域含有PACE(Proteasomeassociatedcontro

3、lelement)序列，而RPN4正是這段順式轉(zhuǎn)錄元件的反式轉(zhuǎn)錄因子，并且其自身的降解也必須靠蛋白酶體來(lái)實(shí)現(xiàn)。這暗示了一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在：RPN4上調(diào)蛋白酶體亞基的水平，上調(diào)的亞基組裝成有活性的蛋白酶體又反過(guò)來(lái)降解自身的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而將其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——蛋白酶體亞基維持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平，保證細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。本論文的結(jié)果提供了直接的證據(jù)證明負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在，首先在兩種不同的蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)觀察到RPN4蛋白的

4、半衰期大大延結(jié)果23261.26S蛋白酶體活性受損穩(wěn)定了RPN4并導(dǎo)致其下游基因PRE6表達(dá)量上升232.26S蛋白酶體活性受損導(dǎo)致其自身亞基的轉(zhuǎn)錄水平上升23243.26S蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)亞基表達(dá)量的升高是RPN4依賴性的244.RPN4穩(wěn)定性的增強(qiáng)可以直接誘導(dǎo)蛋白酶體亞基表達(dá)量升高2426討論2627版圖與說(shuō)明2734第二章RPN4蛋白酶體負(fù)反饋調(diào)控對(duì)蛋白酶體突變株存活和生長(zhǎng)的影響3445摘要3435前言3536材料與方法3

5、637結(jié)果37391.在蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)同時(shí)缺失RPN4會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈的合成致死37382.在RPN4基因缺失的菌株內(nèi)表達(dá)末端帶有TAG的蛋白酶體亞基PRE2同樣導(dǎo)致強(qiáng)烈的合成致死38393.精確測(cè)量上述不同基因型的子代酵母和親本酵母在生長(zhǎng)速度和存活率方面的差異39討論3942版圖與說(shuō)明4245第三章DNA損傷修復(fù)中的RPN4蛋白酶體反饋調(diào)控4557摘要4546前言4647材料與方法4749結(jié)果49501在DNA損傷試劑MMS作用下

6、蛋白酶體表達(dá)量的上升是RPN4依賴的49502驗(yàn)證在DNA損傷試劑MMS作用下RPN4蛋白酶體反饋調(diào)控機(jī)制的存在50討論5052版圖與說(shuō)明5257第四章RPN4泛素依賴的降解途徑的E3UBR2的發(fā)現(xiàn)5768摘要5758前言58材料與方法5859結(jié)果59611在所有已知的E3中只有UBR2的缺失才能穩(wěn)定RPN4(11229)59602UBR2的缺失使得全長(zhǎng)RPN4的穩(wěn)定性增強(qiáng)6061討論6162版圖與說(shuō)明6268第五章RPN4多聚泛素化反