植物組織培養(yǎng)與器官培養(yǎng)

1、2024/3/27,1,第3章 植物組織與器官培養(yǎng),植物組織培養(yǎng)：將離體的植物組織（器官、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體）等在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。{誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽}植物器官培養(yǎng)：將誘導(dǎo)的或植株上原有的各種器官，放在無(wú)菌的人工環(huán)境中讓其進(jìn)一步發(fā)育，最終長(zhǎng)成幼苗或大量繁殖的過(guò)程。,植物離體無(wú)性繁殖,簡(jiǎn)稱離體繁殖（in vitro propagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用離體

2、培養(yǎng)技術(shù)將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，并在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的植株的方法（技術(shù)）。用這種方法得到的植株群體稱單株無(wú)性系。(來(lái)自一個(gè)單株（或一個(gè)單芽），它們遺傳組成相同),近400種植物離體繁殖已獲成功。蘭花、無(wú)子西瓜、馬鈴薯、楊樹(shù)等已在種苗生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。,植物離體無(wú)性繁殖的意義（優(yōu)越性）,,繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高,,占用空間小，不受地區(qū)季節(jié)限制，便于工廠化育苗,,可以繁殖各種珍稀、涉危苗

3、木,離體繁殖周期：1～3個(gè)月繁殖系數(shù)：幾十～幾百倍又稱快繁,離體繁殖是建立在體細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，是在人工控制的環(huán)境條件下，不會(huì)造成性狀分離，也不會(huì)退化，同時(shí)還可避免病蟲(chóng)害的侵染。,,利于篩選突變體，為育種服務(wù),手指玫瑰,由根組織培養(yǎng)的蒲公英幼苗,植物離體無(wú)性繁殖的方式,器官發(fā)生型(organogenesis type)胚狀體發(fā)生型(embryogenesis type)不定芽型（adventitious bud type)器官型

4、(organ type)原球莖型(protocorm type)球莖芽型 塊莖型鱗莖型孢子型根莖型 微枝扦插型,器官發(fā)生型(organogenesis type)：,誘導(dǎo)器官外植體產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織要早期挑選，使其來(lái)源盡量一致。特點(diǎn)：繁殖速度快；培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織階段再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異。,蘆薈、煙草、油菜等,2024/3/27,7,無(wú)菌母

5、株制備,增殖、分化,植株再生及鑒定,,,煉苗和移植,,培養(yǎng)基中激素配比,,,,,,,,激素種類及濃度,基本培養(yǎng)基組成,滲透壓,逐步過(guò)渡,培養(yǎng)基篩選,材料滅菌,胚狀體發(fā)生型(embryogenesis type)：,指植物器官、組織和細(xì)胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。技術(shù)關(guān)鍵：提高不同外植體胚狀體發(fā)生及萌發(fā)率和提高胚狀體同步化率。特點(diǎn)：胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整，繁殖系數(shù)高；遺傳性穩(wěn)定。,甘蔗、胡蘿卜、石刁柏等,不

6、定芽型（adventitious bud type)：,選取具有頂芽和腋芽的短枝無(wú)菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)成苗或增殖產(chǎn)生許多不定芽發(fā)育成苗，將新萌生的枝條再轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽到苗的增殖過(guò)程，最后使其生根形成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：打破頂端優(yōu)勢(shì)，促使腋芽增殖并促其生根。特點(diǎn)：繁殖率高、保持物種的遺傳穩(wěn)定性，多用于林木的繁殖。,FLash,器官型(organ type),指直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導(dǎo)不定芽或帶芽的休眠器官（如小鱗莖、小球莖、

7、小塊莖）產(chǎn)生再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：對(duì)培養(yǎng)基要求高，控制好激素濃度，避免愈傷組織發(fā)生。優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，速度較快；遺傳性穩(wěn)定。,三倍體無(wú)籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、絲石竹等,原球莖型(protocorm type),蘭屬特有的方式，即外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖，再直接長(zhǎng)成植株。,,球莖芽型,葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根,遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植,唐菖蒲,觀葉海棠,塊莖型,葉片或葉柄上形成

8、粒狀芋塊，進(jìn)一步分化出芽和根塊莖芽可為繁殖系母體，不斷切割繁殖移栽，成活率高 ?；ㄈ~芋,鱗莖型,鱗片近軸面或邊緣直接形成帶根的小鱗莖 在試管內(nèi)形成小鱗莖需較長(zhǎng)時(shí)間 百合 郁金香,孢子型,用成熟或未成熟的孢子進(jìn)行培養(yǎng) 孢子繁殖最困難的是表面消毒，萌發(fā)時(shí)間較長(zhǎng) 地錢(qián),狼尾蕨,根莖型,蕨類具有橫向的莖及直立的短根莖，為組織培養(yǎng)的最佳外植體 根狀莖上產(chǎn)生蕨葉及根，繁殖速度較孢子型快腎蕨等,微枝扦插型,

9、帶芽的小插條在試管內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌扦插 為木本植物進(jìn)行快速繁殖的主要方式 葡萄、楊樹(shù),2024/3/27,18,3.1.3 培養(yǎng)基,3.1.3.1 無(wú)機(jī)鹽,無(wú)機(jī)鹽,培養(yǎng)基的組成,大量元素(使用濃度大于0.5mmol/L)微量元素(使用濃度小于0.5mmol/L),2024/3/27,19,,3.1.3.1 無(wú)機(jī)鹽,2024/3/27,20,3.1.3.2有機(jī)物,氨基酸類 重要的有機(jī)氮源維生素類 以輔酶形式參與植物細(xì)胞代謝活動(dòng)，

10、對(duì)生長(zhǎng)、分化具有很好的促進(jìn)作用 vb1， vb6糖類 主要的碳源—蔗糖？天然有機(jī)添加物類 CM（椰乳）、馬鈴薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等,2024/3/27,21,蔗糖濃度分別為0、1%、5%,2024/3/27,22,3.1.3.3 調(diào)節(jié)物質(zhì),（一）生長(zhǎng)素類 促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和分裂、誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)生根，與一定量的細(xì)胞分裂素配合可誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的產(chǎn)生等。常用的有2,4-D、

11、NAA、IBA、IAAIAA為天然植物生長(zhǎng)素，見(jiàn)光易分解，高溫高壓易受破壞；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于細(xì)胞啟動(dòng)脫分化階段；誘導(dǎo)分化則用NAA、NBA或IAA。IBA誘導(dǎo)生根效果最好。,2024/3/27,23,（二）細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化不定芽、解除頂端優(yōu)勢(shì)而促進(jìn)側(cè)芽增殖、抑制離體組織或器官衰老。常用的有6-BA、 KT 、 ZT,6-BA,2024/3/27,24,BA分別

12、為0, 0.1, 5mg/L,NAA分別為0, 0.1, 5mg/L,2024/3/27,25,,（三）赤霉素類 主要應(yīng)用GA3，促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育成小植株，GA3不耐熱，水溶解后不穩(wěn)定，應(yīng)采用過(guò)濾除菌，并用酒精溶解。脫落酸 抑制蛋白質(zhì)合成，抵消和抑制上述三種激素發(fā)揮作用；誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落。乙烯,2024/3/27,26,3.1.3.4 植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制,培養(yǎng)基母液的配制大量元素一般配成10倍濃度

13、的母液；微量元素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)常配成100倍濃度的母液；混合定容時(shí)，注意藥劑的添加順序及稀釋度，以免沉淀；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì)不溶于水,需用不同溶劑進(jìn)行溶解單獨(dú)配制的試劑：鐵鹽與EDTACaCl2,,,,前P28,2024/3/27,27,以KNO3為例,1L培養(yǎng)基需要量為19g。,在配制母液時(shí)，增加10倍量，為190g。在母液中的濃度為190g/L，即0.19g/ml,,在配制培養(yǎng)基時(shí)，取10ml，10ml×0.19g/m

14、l=19g,,,回P26,2024/3/27,28,3.1.3.4 植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制,培養(yǎng)基配制過(guò)程藥品 按順序混合 pH調(diào)整 加熱溶解器皿 水洗 干燥 分裝培養(yǎng)基 加塞 冷卻 高壓蒸汽滅菌,,,,,,,,,,2024/3/27,29,3.1.3.5 常用培養(yǎng)基,到目前研制開(kāi)發(fā)了數(shù)十種適宜不同植物、不同組織、不同細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)基配方。但多數(shù)培養(yǎng)基配方是在幾種普遍應(yīng)用的培

15、養(yǎng)基上演變而來(lái)的。這幾種常見(jiàn)的培養(yǎng)基為是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：,2024/3/27,30,,,2024/3/27,31,培養(yǎng)基分類,根據(jù)培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽含量的差異將其分為以下4類：①高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（植物器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)）；-MS②較高硝酸鹽含量培養(yǎng)基（木本、十字花科和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)）；-B5③中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（花藥培養(yǎng)）；-H④低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（生根）。-WH

16、ITE,2024/3/27,32,3.1.4 植物組織培養(yǎng)問(wèn)題分析,3.1.4.1試管苗玻璃化現(xiàn)象（vitrification） 是指組織培養(yǎng)過(guò)程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。 玻璃化苗絕大多數(shù)為 來(lái)自莖尖或莖段 培養(yǎng)物的不定芽。 通常玻璃化苗 恢復(fù)正常的比例很低， 在繼代培養(yǎng)中仍然 形成玻璃化苗。,2024/3/27,33,玻璃化的解決方法,增加培養(yǎng)基中的溶

17、質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)；減少培養(yǎng)基中NH4+濃度；增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。,2024/3/27,34,3.1.4.2 褐變問(wèn)題,成因酶促----酚氧化成醌及聚合非酶促----醌聚合時(shí)段初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng),2024/3/27,35,① 選擇合適的

18、外植體 一般來(lái)說(shuō)，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。② 合適的培養(yǎng)條件 無(wú)機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③ 使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。④ 材料預(yù)處理和細(xì)胞篩選⑤ 使用吸附劑 0.1%-0.5%的活性炭、PVP對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。⑥ 連續(xù)轉(zhuǎn)移 對(duì)容易褐變的材料可間

19、隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過(guò)連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。,減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法,2024/3/27,36,3.1.4.3 微生物污染問(wèn)題,原因消毒不徹底外植體消毒問(wèn)題培養(yǎng)基及器皿消毒問(wèn)題環(huán)境消毒問(wèn)題無(wú)菌操作不過(guò)關(guān),,2024/3/27,37,外植體消毒問(wèn)題,,外植體取材 外植體(expant)是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織。來(lái)源：,2024/3/27,38,,外植體

20、消毒問(wèn)題,外植體滅菌的過(guò)程：流水沖洗10~20min表面消毒無(wú)菌水沖洗4~5次 瀝水待用 Flash,2024/3/27,39,常用消毒劑消毒滅菌效果比較,2024/3/27,40,培養(yǎng)基及器皿消毒滅菌問(wèn)題,培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所需的最少時(shí)間,2024/3/27,41,培養(yǎng)基滅菌,培養(yǎng)基組成中若含有遇熱易分解物質(zhì)，如 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素、尿素、酶等，則必須用過(guò)濾法除菌。 過(guò)濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22~0.45μm

21、或更小的細(xì)菌濾膜。 過(guò)濾除菌可利用抽濾裝置或注射過(guò)濾器進(jìn)行，所用器皿均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓消毒滅菌，滅菌溫度不超過(guò)121℃。,2024/3/27,42,器皿消毒滅菌,手術(shù)刀鑷子平皿干熱滅菌 150-160℃，2h,2024/3/27,43,環(huán)境消毒問(wèn)題,,2024/3/27,44,無(wú)菌操作問(wèn)題評(píng)價(jià)下列操作正確與否,2024/3/27,45,評(píng)價(jià)下列操作正確與否,2024/3/27,46,評(píng)價(jià)下列操作正確與否,2024/3/27,47,

22、評(píng)價(jià)下列操作正確與否,2024/3/27,48,無(wú)菌操作,無(wú)菌操作前的準(zhǔn)備工作無(wú)菌操作臺(tái)的使用操作所用器械應(yīng)浸泡在95%酒精中，用前需放在耐熱器皿中加入少量酒精后進(jìn)行灼燒，每次使用后都要滅菌。無(wú)菌操作步驟外植體的適當(dāng)切割的注意事項(xiàng)繼代培養(yǎng)的材料(液體材料、固體材料）,2024/3/27,49,3.1.4.4 其他問(wèn)題,培養(yǎng)條件控制,激素水平光照：時(shí)間，強(qiáng)度和光質(zhì)。溫度：適溫有利于細(xì)胞分裂與分化，而在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度可

23、以使細(xì)胞的質(zhì)量增加；培養(yǎng)基晝夜變溫可能有利于器官的發(fā)生。pH 通常使用的pH值的范圍是5.5－6.5。pH7，培養(yǎng)物不能正常生長(zhǎng)。氣體,2024/3/27,50,激素水平的控制,生長(zhǎng)素應(yīng)用的濃度范圍為0.1~15mg/L。在細(xì)胞脫分化過(guò)程中，啟動(dòng)細(xì)胞分裂形成愈傷組織，以2,4-D最為有效。細(xì)胞脫分化需要高濃度的2,4-D，當(dāng)胚性細(xì)胞形成轉(zhuǎn)入再分化時(shí)，則需較低的2,4-D濃度。使用濃度范圍為0.1~10mg/L。細(xì)胞分裂素既可

24、誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，又可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。,2024/3/27,51,,16h/d,24h/d,0h/d,光照時(shí)間的影響,2024/3/27,52,液體振蕩培養(yǎng)的愈傷組織生長(zhǎng)與振蕩頻率的關(guān)系,2024/3/27,53,3.2 植物胚胎培養(yǎng),Flash,2024/3/27,54,,,概念,花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇,花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)范疇也稱小孢子培養(yǎng),花藥及花粉培養(yǎng),把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成植株的過(guò)程,從花

25、藥中分離出花粉粒使之成為分散或游離的狀態(tài)，通過(guò)培養(yǎng)使其脫分化并發(fā)育成植株的過(guò)程,2024/3/27,55,獲得單倍體植株花藥培養(yǎng)的基本程序： Flash選處于生殖生長(zhǎng)高峰期的花藥，需低溫預(yù)處理（3～10℃，2～10天），光照先弱后強(qiáng)。,花藥培養(yǎng)目的及程序,2024/3/27,56,花粉或小孢子的分離,花粉或小孢子培養(yǎng)目的及方法,目的：獲得單倍體植株,2024/3/27,57,花藥看護(hù)培養(yǎng)花粉懸浮培養(yǎng)固液雙層培養(yǎng),花粉培養(yǎng)方法,

26、2024/3/27,58,2024/3/27,59,3.3 毛狀根培養(yǎng),定義：毛狀根(hairy roots)是（雙子葉）植株或組織、器官經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）感染后，形成的類似頭發(fā)一樣的根組織。又稱發(fā)狀根。,1934年，Hildebrand 報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋(píng)果樹(shù)產(chǎn)生發(fā)根 。,2024/3/27,60,毛狀根的特性,特性：毛狀根可以不依賴激素快速生長(zhǎng)，根多叢生，多分枝，多根毛，無(wú)向地性

27、。生理生化和遺傳穩(wěn)定。為什么可以不依賴激素？發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中。T-DNA上有生長(zhǎng)素合成基因tms 1 和tms 2能夠指導(dǎo)IAA的合成。,2024/3/27,61,3.3.1 毛狀根的誘導(dǎo),3.3.1.1 外植體接種法 ---共培養(yǎng)3.3.1.2 莖稈接種法3.3.1.3 原生質(zhì)體-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法,2024/3/27,62,生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素,青蒿：為雙子葉植物藥

28、菊科植物青蒿素：,倍半萜內(nèi)酯類化合物功效：治療瘧疾,2024/3/27,63,,1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught

29、 cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebulizing device, 15. 40W fluorescent lamp,2024/3/27,64,2024/3/27,65,生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素,2024/3/27,66,Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in t

30、he mist bioreactor (a) 0 d ; (b) 10 d ;,,10cm,,30cm,2024/3/27,67,生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素,實(shí)驗(yàn)材料青蒿毛狀根：由發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生培養(yǎng)方法及條件1. 固體培養(yǎng)20～30 mm青蒿毛狀根根尖MS固體培養(yǎng)基(添加30 L蔗糖)繼代時(shí)同為15d,2024/3/27,68,生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素,培養(yǎng)方法及條件2.

31、液體振蕩培養(yǎng)（三角瓶）接種量：每L培養(yǎng)液（MS）5 g 毛狀根培養(yǎng)物（分支多且細(xì)長(zhǎng)的毛狀根）120-130 rpm，25±1 ℃，12 h／d光照液體培養(yǎng)的繼代時(shí)間為10 d。 反應(yīng)器培養(yǎng)反應(yīng)器中的培養(yǎng)液(MS)為400mL，接種量為0.8g12 h／d培養(yǎng)，25±I℃ 。霧化間隔30 min，霧化2min。通氣量為0.5 L／min，通氣時(shí)間為15 mln。,2024/3/27,69,最大生物量10