花生種子貯藏蛋白的熱穩(wěn)定性與氨基酸組成的關(guān)系

1、研究報告花生種子貯藏蛋白的熱穩(wěn)定性與氨基酸組成的關(guān)系Ξ蘆春斌(暨南大學(xué)生殖免疫中心廣州510632)黃上志傅家瑞(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣州510275)摘要:分析兩種不同蛋白類型的花生種子貯藏蛋白熱穩(wěn)定性表明各品種類型花生種子貯藏蛋白的3種主要組分的的熱穩(wěn)定性存在顯著的差異即伴花生球蛋白?熱穩(wěn)定性最高伴花生球蛋白?次之花生球蛋白最低。高甲硫氨酸品種類型(汕油523)的貯藏蛋白中無論花生球蛋白還是伴花生球蛋白?的熱穩(wěn)定性都高于低甲硫氨酸品

2、種類型(?；?號)相應(yīng)組分的熱穩(wěn)定性。氨基酸分析表明各品種3種組分中17種氨基酸中的大多數(shù)氨基酸含量無顯著變化并且天冬氨酸谷氨酸和精氨酸的含量最高三者之和可達總量的45%以上:3種組分中伴花生球蛋白?除了谷氨酸和精氨酸含量顯著高于花生球蛋白伴花生球蛋白?外含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)也明顯高于后兩者。3個組分中含硫氨基酸水平與熱穩(wěn)定性正相關(guān)即含硫氨基酸水平越高其熱穩(wěn)定性越高。冷藏過程中含硫氨基酸高的伴花生球蛋白?不易降解、保持高熱穩(wěn)

3、定性水平。關(guān)鍵詞花生貯藏蛋白氨基酸組成熱穩(wěn)定性在種子成熟過程中種子中大量合成包括貯藏蛋白在內(nèi)的多種特異性蛋白。貯藏蛋白是花生種子中的一種主要的貯藏成分。花生種子發(fā)育和萌發(fā)中的一些重要生理過程如耐脫水力的形成、種子活力保持等與其貯藏蛋白密切相關(guān)[1]。據(jù)報導(dǎo)成熟種子中提取的蛋白質(zhì)大多具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性[2]種子貯藏蛋白中的熱穩(wěn)定組分與萌發(fā)種子回干后萌發(fā)能力的關(guān)系也有報道[3]。種子貯藏蛋白的氨基酸組成與耐熱能力有關(guān)[4]。研究表明

4、不同品種花生種子的蛋白質(zhì)含量和組成存在著明顯差異[56]。我們近期對國內(nèi)40多個花生品種以及36個高蛋白含量花生品種進行蛋白質(zhì)組成分析結(jié)果確證了這些栽培花生品種是存在Krishna[7]報導(dǎo)的四種蛋白的組成模式而且不同模式的種子氨基酸含量存在明顯差異[8]。本文分析了高甲硫氨酸品種類型(汕油523)和低甲硫氨酸品種類型(?；?號)兩種多肽組成類型品種花生種子貯藏蛋白的3個主要組分的熱穩(wěn)定性、氨基酸組成以及冷藏過程中熱穩(wěn)定性與游離氨基酸的

5、變化探討了貯藏蛋白熱穩(wěn)定性與氨基酸組成的關(guān)系。1材料和方法1.1材料汕油523花生(ArachishypogaeaL)收自廣東省農(nóng)科院經(jīng)濟作物所。?；?號由山東省花生研究所提供。1.2方法1.2.1貯藏蛋白的提取及初步純化貯藏蛋白的提取參照Yamada等[9]方法提取種子貯藏蛋白的花生球蛋白。伴花生球蛋白?和伴花生球蛋白?的制備按Mosse和Pernollet[10]的方法進行。以上3種蛋白組分溶于20mol?L磷酸緩沖液中經(jīng)過Seph

6、adexG2100凝膠柱(1090cm)純化流速12ml?h280nm記錄A值、收集蛋白峰部分。1.2.2氨基酸組成測定采用酸水解法[8]用日立8352050型高速氨基酸分析儀測定。1.2.3游離氨基酸的測定按張龍翔等的茚三酮顯色法[11]賴氨酸為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。1.2.4蛋白組分的熱處理取上述SephadexG2100純化的各蛋白組分100℃沸水浴處理15min后冰浴30min使之冷卻10000g離心15min上清液即為熱穩(wěn)定蛋白。1.2

7、.5蛋白含量的測定按照Bradfold[12]的方法電泳純牛血清蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)測定波長595nm。2結(jié)果2.1兩個不同品種花生子葉貯藏蛋白各組分的穩(wěn)定性這兩個不同品種花生貯藏蛋白各組分熱穩(wěn)定性結(jié)果表明(圖1)各種類型品種花生貯藏蛋白的3種組分之間的熱穩(wěn)定性存在顯著的差異即小分子多肽為主的伴花生球蛋白?熱穩(wěn)定性最高伴花生球蛋白?次之花生球蛋白最低伴花生球蛋白?是花生種子貯藏蛋白中熱穩(wěn)定性最高的組分其蛋白質(zhì)中的90%以上為熱穩(wěn)定性蛋白

8、。比較這兩個不同類型品種的花生的這3種組分的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)高甲硫氨酸品種類型(汕油523)的貯藏蛋白中無論花生球蛋白還是伴花生球蛋?的熱穩(wěn)定性都高于低甲硫氨酸品種類型(海花1號)相應(yīng)組分的熱穩(wěn)定性只有汕油523伴花生球蛋白?的熱穩(wěn)定性略低于?；?號伴花生球蛋?。3種子Seed2001年第3期(總第115期)Ξ廣東省自然科學(xué)基金(950090)資助課題離氨基酸的含量開始大幅度持續(xù)增加在120天時已經(jīng)達到0.45mmo1?L。其熱穩(wěn)定性變化分

9、析表明冷藏15天內(nèi)熱穩(wěn)定性蛋白的比例先是急劇上升在7天時可達到最大值15天時仍高于冷藏開始時的水平其后明顯下降30天后熱穩(wěn)定性蛋白降低的速率減慢并以較低的水平維持較長時間。雖然冷藏過程中伴花生球蛋白?中蛋白含量的變化與花生球蛋白的變化具有相似的規(guī)律也呈逐步下降趨勢但其下降的速率遠(yuǎn)低于花生球蛋白。冷藏30天以前蛋白質(zhì)含量減少相對較明顯30天時其含量僅降低了8%此后蛋白質(zhì)含量幾乎完全停止下降(圖4、圖5)。相應(yīng)地其游離氨基酸水平冷藏前30天

10、只有輕微增加到30天時其水平達到0.10mmo1?L左右之后其含量極少增加到120天時僅為0.13mmo1?L不到花生球蛋白中游離氨基酸水平的30%。伴花生球蛋白?中的熱穩(wěn)定蛋白的變化冷藏15天時僅增加4%然后下降30天時恢復(fù)至原有水平其后幾乎保持不變。3討論近年對貯藏蛋白的研究認(rèn)為貯藏蛋白不僅局限于是為種子萌發(fā)和幼苗生長提供營養(yǎng)而且它們也參與種子發(fā)育和萌發(fā)過程的調(diào)控。黃上志等的研究中發(fā)現(xiàn)貯藏蛋白與種子活力、種子耐脫水性有一定的相關(guān)性花

11、生及其它種子的鹽溶蛋白有較高的親水性和熱穩(wěn)定性[2]。尤其是花生胚軸中的小分子熱穩(wěn)定蛋白對維持回干種子的萌發(fā)和生長有重要作用[3]。本實驗分析比較了對兩種不同蛋白質(zhì)類型花生的各組分的熱穩(wěn)定性各品種的小分子伴花生球蛋白?多肽的熱穩(wěn)定性最高伴花生球蛋白?次之花生球蛋白最低而且高甲硫氨基酸品種類型(汕油523)的貯藏蛋白中花生球蛋白、伴花生球蛋?的熱穩(wěn)定性都高于低甲硫氨酸品種類型(?；?號)相應(yīng)組分的熱穩(wěn)定性。分析比較汕油523和?；?號貯藏

12、蛋白3個主要組分的氨基酸組成這兩個品種花生各蛋白組分中天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯異氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸無顯著變化它們是種子貯藏蛋白中的各種多肽的基本結(jié)構(gòu)組分高度保守對維持各多肽的結(jié)構(gòu)有重要意義。Higgins[4]等認(rèn)為耐熱能力與種子貯藏蛋白的獨特的氨基酸組成有關(guān)即其含有大量的谷氨酸(酰胺)、甘氨酸、精氨酸含有較少的中性氨基酸。本實驗結(jié)果證實種子貯藏蛋白的各主要組分含有大量的天冬氨酸、谷氨酸(

13、酰胺)、甘氨酸、精氨酸中性氨基酸較少是其熱穩(wěn)定性高的一個原因此外在貯藏蛋白的3個組分中伴花生球蛋白?的蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸含量較低而谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸水平則較高?；ㄉ虻鞍装榛ㄉ虻鞍?和?的含硫氨酸含量依次提高它們的熱穩(wěn)定性也相應(yīng)增強說明含硫氨基酸水平與熱穩(wěn)定性有密切聯(lián)系。推測其原因是含硫氨基酸的巰基在蛋白亞基內(nèi)部及亞基之間構(gòu)成二硫鍵維持蛋白的正確空間構(gòu)象使它們具有較高的熱

14、穩(wěn)定性。因此種子貯藏蛋白氨基酸組成及其特定空間結(jié)構(gòu)是它們熱穩(wěn)定性的物質(zhì)基礎(chǔ)。冷藏早期花生球蛋白和伴花生球蛋白?的熱穩(wěn)定性組分比例均有不同程度的提高這種熱穩(wěn)定性蛋白的比例增加是與蛋白質(zhì)含量降低游離氨基酸水平提高同步的。游離氨基酸水平增加是因為冷藏后某些蛋白質(zhì)發(fā)生變性降解所致同時蛋白質(zhì)降解、游離氨基酸水平增加使熱穩(wěn)定性組分相對比例增加。同樣冷藏后花生球蛋白和伴花生球蛋白?的熱穩(wěn)定性的變化也充分說明含硫氨基酸高的伴花生球蛋白?不易降解、熱穩(wěn)定

15、性高。參考文獻1黃上志傅家瑞.花生種子的發(fā)育與貯藏蛋白質(zhì)的合成和積累.植物生理學(xué)報199218(2):142～1502JacobsenJVShawDC.Heat2Stableproteinsasscisicacidactioninbarleyaleuronecells.PlantPhysiol.198991:1520～15263黃上志王冬梅蘆春斌傅家瑞.萌發(fā)中花生胚軸的耐干性與熱穩(wěn)定蛋白.植物生理學(xué)報199925(2):193～1984

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