幾種赤潮微藻的分子鑒定技術研究.pdf

1、有害赤潮正成為越來越嚴重的全球性海洋災害。赤潮微藻傳統(tǒng)的分類鑒定主要以形態(tài)學特征為基礎，需借助顯微鏡對微藻進行鑒別，因而具有經(jīng)驗豐富的微藻分類學專家才能勝任，因此不利于對大樣品量的處理，不能達到快速檢測的需要。由于不同種屬間基因的多樣性，分子生物學技術常被用于赤潮微藻的分類和鑒定。本文以環(huán)介導的恒溫擴增技術（即LAMP技術）和實時定量PCR技術為研究手段，對幾種典型的赤潮微藻的快速檢測和定量鑒定開展了研究。同時對目標藻引物設計、篩選、驗

2、證開展了研究，并對這些引物進行了實驗室驗證以及初步模擬現(xiàn)場樣品檢測。本文的主要研究內容和結果包括以下幾個方面：
　　 1.赤潮微藻基因組DNA的快速制備研究。
　　 本研究以塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、環(huán)狀異帽藻（Heterocapsa circularisquama）和角毛藻（Chaetoceros sp.）為研究對象，采用超聲波法、煮沸法和微波法等3種方法分別對塔瑪亞歷山大藻（Ale

3、xandriumtamarense）、環(huán)狀異帽藻(Heterocapsa circularisquama)和角毛藻(Chaetoceros sp.)進行細胞破碎及快速制備基因組DNA的研究。通過細胞計數(shù)和DNA濃度測定的手段對三種方法進行了比較，以選擇適合不同藻種的細胞破碎方法。結果表明，塔瑪亞歷山大藻和環(huán)狀異帽藻用超聲波法破碎效果較好；角毛藻用微波法較好。用該三種方法制備的基因組DNA做了PCR擴增，電泳檢測表明，與CTAB法擴增效果

4、一樣。本文建立的微藻DNA快速制備方法有望應用在赤潮藻類的快速分子鑒定方面。
　　 2.環(huán)介導的恒溫擴增技術快速檢測幾種典型赤潮微藻的研究
　　 本研究以鏈狀亞歷山大藻(A. catenella)、微小亞歷山大藻(A. minutum)、短凱倫藻(K. brevis)和微小原甲藻(P. minimum)為研究對象，首先獲得了四種目標藻的ITS序列，然后對得到的序列和相近屬種的其他微藻進行比對分析，選取合適的基因片段設計引

5、物，通過篩選，獲得最佳引物。每種都以其他8種藻作為陰性對照進行LAMP檢測和以外引物F3/B3進行常規(guī)PCR擴增和測序，以驗證目標藻的引物特異性。同時，對目標藻的基因組DNA進行一系列10倍稀釋，進行了敏感度檢測并與常規(guī)PCR做了對比，得出鏈狀亞歷山大藻、微小亞歷山大藻、短凱倫藻和微小原甲藻的最低檢測限度依次為5.6pg、4.5pg、50pg、3.6pg，敏感度比常規(guī)PCR高10-100倍。該方法引入肉眼檢測的方法，陽性反應會出現(xiàn)白色混

6、濁，與SYBR Green I反應呈現(xiàn)綠色，該檢測方法簡便且省去了膠電泳的過程。本研究所建立的LAMP技術特異性好，靈敏度高，穩(wěn)定性好，重復性好，檢測速度快，整個過程在恒溫65℃條件下，核苷酸的擴增和檢測在1個小時內即可完成，有利于處理大量的樣本；不僅可以對高濃度時的微藻樣品進行快速檢測，也可以對低濃度樣品進行檢測。
　　 3.實時熒光定量PCR方法鑒定和定量檢測環(huán)狀異帽藻和微小原甲藻
　　 首先獲得了環(huán)狀異帽藻和微小原

7、甲藻的ITS序列，然后對得到的序列和相近屬種的其他微藻進行比對分析，使用Primer Express3.0軟件，以目標藻的ITS1區(qū)為靶序列設計特異性引物，通過篩選，獲得最佳引物，并對引物進行了特異性驗證，以其他相近屬種的9赤潮微藻為陰性對照，以驗證目標藻種的引物特異性。同時，以超聲波破碎藻液為模板，進行一系列10倍稀釋，進行敏感度檢測，環(huán)狀異帽藻和微小原甲藻的最低檢測限度分別為0.5個細胞和0.1個細胞。初步模擬現(xiàn)場樣品檢測，以含目標

8、藻超聲波破碎藻液與其他藻液的混合物為陽性對照的模板，不含目標藻的藻液混合物為陰性對照的模板，得出其他藻的藻液對目標藻的Real-time PCR擴增沒有影響。本研究Real-time PCR的標準品采用超聲波破碎所得到的破碎藻液，以該標準品所得到的標準曲線，環(huán)狀異帽藻的標準曲線方程為y=-3.603x+32.598，相關系數(shù)為R2=0.989；微小原甲藻的標準曲線方程為V=-3.277x+43.708，相關系數(shù)R2=0.993。以上述超