幾種重要豆象的遺傳分化及分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、豆象科Bruchidae昆蟲(chóng)主要取食豆類(lèi)的種子,以幼蟲(chóng)在豆粒內(nèi)鉆蛀為害,是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)。目前在我國(guó)分布廣泛、危害性大的豆象科昆蟲(chóng)主要有三種:豆象屬Bruchus的蠶豆象Bruchus rufimanus Behoman和豌豆象Bruchus pisorum(Linnaeus),以及瘤背豆象屬Callosobruchus的四紋豆象Callosobruchus maculatus(Fabricius),其中四紋豆象是我國(guó)進(jìn)

2、境植物檢疫性有害生物之一。因此,開(kāi)展該類(lèi)害蟲(chóng)的研究具有重要意義。
　　 本文對(duì)上述3種豆象科昆蟲(chóng)不同地理種群線粒體DNA(mtDNA)的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COI)基因、細(xì)胞色素b脫輔基酶(Cytb)基因進(jìn)行測(cè)序,并結(jié)合網(wǎng)上發(fā)布的該類(lèi)昆蟲(chóng)的有關(guān)COI和Cytb基因序列,對(duì)其不同地理種群和種間親緣關(guān)系進(jìn)行探討;同時(shí),根據(jù)已測(cè)mtDNA COI基因序列設(shè)計(jì)了兩套用于快速鑒定四紋豆象及其近緣種的特異性引物,并對(duì)該引物檢測(cè)的靈敏度和

3、穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,其主要結(jié)果如下:
　　 1、通過(guò)實(shí)驗(yàn),篩選出一種較穩(wěn)定,且能大規(guī)模在實(shí)驗(yàn)室條件下提取豆象不同種類(lèi)基因組DNA的方法,即CTAB法。經(jīng)過(guò)OD值的測(cè)定和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),證明了該方法得到的DNA樣品完全可以滿足PCR引物擴(kuò)增要求。通過(guò)對(duì)比酒精浸泡、陰干和烘干三種保藏方法豆象標(biāo)本的提取結(jié)果表明,該方法可以用于酒精浸泡和烘干保存標(biāo)本的基因組DNA的提取,且有較好的提取效果;但對(duì)陰干保藏標(biāo)本的提取效果差。
　　 2、豆象

4、科部分種類(lèi)mtDNACytb(12種)和COI(13種)基因序列的分析表明,這兩種基因表現(xiàn)出強(qiáng)烈的A+T偏向,分別為69.8％和66.8％,第三位A或T的偏好更加明顯,均為85.0％。核苷酸的替代轉(zhuǎn)換明顯高于顛換,顛換的發(fā)生主要以A/T為主,大都發(fā)生在密碼子第三位。密碼子第3位點(diǎn)的高A+T含量與氨基酸的變異存在一定的相關(guān)性。密碼子以A,T結(jié)尾頻率高,第三位是G的密碼子使用較少,反映出Cytb和COI基因在密碼子的使用上具有偏向性。用兩種

5、建樹(shù)方法(距離法和最簡(jiǎn)約法),基于COI和Cytb基因構(gòu)建的豆象科部分種類(lèi)的系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致,同屬的種類(lèi)分別聚在一起。
　　 3、從上述三種豆象不同地理種群mtDNA基因(COI、Cytb)的單倍型和分布格局來(lái)看,各地理種群中很少有獨(dú)享單倍型存在,說(shuō)明種群間的遺傳分化程度較低;基于2個(gè)基因的地理種群間的基因流顯示,各種群間既存在著一定數(shù)量的基因交流,也存在一定程度的遺傳分化。豌豆象不同地理種群間的COI基因和Cytb基因

6、的遺傳分化研究表明,Cytb基因江蘇種群與甘肅種群間Nm值小于1,而COI基因Nm值大于1,可見(jiàn)豆象的Cytb基因進(jìn)化速度比COI基因快。COI和Cytb基因都是研究蠶豆象、豌豆象和四紋豆象地理種群的遺傳分化的良好分子標(biāo)記。
　　 4、根據(jù)已測(cè)mtDNACOI基因序列設(shè)計(jì)了兩套用于快速鑒定豆象種類(lèi)的特異性引物,一套用于從多種豆象中快速鑒定出四紋豆象,另一套用于鷹嘴豆象和四紋豆象兩個(gè)近緣種之間的分子鑒定,并用特異性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一