多靶點(diǎn)pcrispr載體改良版(單子葉植物用)使用方法2014-10-26(p)副本_第1頁
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1、1CRISPRCas9basedgenomeeditingtechnologyACRISPRCas9vectsystemfmultiplextargetingofgenesitesinmonocotplants亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉耀光課題組（ygliu@scau.）1.CRISPRCas9核酸酶切靶序列原理圖核酸酶切靶序列原理圖3注：這些質(zhì)粒保存在E.coliTOP10F’(LacIq)菌

2、株繁殖，以使ccdB(大腸桿菌致死基因)能夠被LacIq產(chǎn)生高水平阻礙蛋白抑制其表達(dá)。GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdBs657bp)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAG

3、TTATTGCATCTATGTCGGGPCRSequencingprimer(SPR原命名SP1):PCRSequencingprimer(SPML原命名SP2)IBLBsaIBsaIBRINotICCCGACATAGATGCAATAACTTC3pCas9NLSIRBLBBsaI(BR)P35:HPTNotIpBR322ipBR322bnKanrNLSNotIpYLCRISPRCas9MH(~16.5kb)(NuclearLocaliz

4、ationSignal)BsaI(BL)PubiccdBsTnospCas9NLSIRBLBBsaI(BR)P35:BarpVS1repliconNotIpBR322ipBR322bnKanrNLSNotIpYLCRISPRCas9MB(~16.5kb)BsaI(BL)ccdBsPubiTnospVS1replicon3.3.基因組靶位點(diǎn)選擇和雙鏈接頭設(shè)計(jì)基因組靶位點(diǎn)選擇和雙鏈接頭設(shè)計(jì)3.1靶位點(diǎn)選擇靶位點(diǎn)選擇（1）在目標(biāo)區(qū)如果能夠找到

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