綠色熒光蛋白標(biāo)記的大麗輪枝菌對(duì)棉花葉片和單子葉植物的侵染研究.pdf

1、棉花是重要的纖維作物和油料作物，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一種土傳維管束系統(tǒng)病害，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量與品質(zhì)。一般認(rèn)為大麗輪枝菌是從棉花的根部直接進(jìn)行侵染，并通過表皮、皮層進(jìn)入維管束組織。在維管束中形成大量的分生孢子和菌絲，阻塞導(dǎo)管，導(dǎo)致葉片萎蔫。此外，大麗輪枝菌產(chǎn)生的毒素和酸性糖蛋白也可以導(dǎo)致棉花的快速萎蔫。關(guān)于土傳病原真菌進(jìn)行葉面侵染的報(bào)道

2、并不常見。在本研究中我們觀察了大麗輪枝菌在棉花葉片進(jìn)行侵染和系統(tǒng)擴(kuò)展的過程，棉葉中防御物質(zhì)的產(chǎn)生及大麗輪枝菌對(duì)禾本科單子葉植物的侵染情況。
　　通過涂抹的方法將綠色熒光蛋白標(biāo)記的大麗輪枝菌V1070-GFP接種在離體棉花葉片的上表皮，發(fā)現(xiàn)接種2小時(shí)后V1070-GFP的孢子便可以萌發(fā)，接著菌絲伸長(zhǎng)并通過氣孔或者直接穿透的方式進(jìn)入表皮細(xì)胞內(nèi)部，而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的部分菌絲又可以從氣孔或者以直接穿透的方式進(jìn)入空氣中。將10μL V1070

3、-GFP接種在棉花幼苗的葉片后，發(fā)現(xiàn)V1070-GFP的孢子可以吸附在棉花葉片，接種2天后會(huì)在接種部位出現(xiàn)褐色病斑，隨后病斑的面積不斷擴(kuò)大。在接種部位大麗輪枝菌的孢子萌發(fā)，菌絲伸長(zhǎng)并可以沿著葉片擴(kuò)展。伸長(zhǎng)的菌絲沿著葉柄表面繼續(xù)向下擴(kuò)展到達(dá)莖部和根部，且胚軸處菌絲的量要明顯多于莖的其他部位。此外，我們發(fā)現(xiàn)大量分生孢子和微菌核在胚軸處形成，這些分生孢子和微菌核可以重新萌發(fā)，并在胚軸處橫向穿透表皮細(xì)胞、皮層進(jìn)入維管束，繼而向下擴(kuò)展。利用稀釋分

4、離法對(duì)葉片中的V1070-GFP進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在接種的前10天，V1070-GFP的量迅速增加，10-30天內(nèi)，葉片中大麗輪枝菌的數(shù)量增加緩慢，趨于穩(wěn)定。
　　分別利用苯胺藍(lán)染色和DAB染色的方法，觀察了接種大麗輪枝菌后棉花葉片中胼胝質(zhì)和過氧化氫的積累情況。發(fā)現(xiàn)接種V1070-GFP后，可以在接種位點(diǎn)觀察到胼胝質(zhì)的沉積，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)胼胝質(zhì)的量不斷增加。接種V1070-GFP24小時(shí)后，在侵染葉片中觀察到過氧化氫的大量積累。此外

5、，我們還通過熒光定量PCR檢測(cè)了防御基因PR1基因、LOX基因和WRKY4基因的表達(dá)情況。定量結(jié)果表明，在病原菌的誘導(dǎo)下，3個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)。
　　利用洋蔥表皮觀察了V1070-GFP孢子的萌發(fā)和侵染情況，發(fā)現(xiàn)V1070-GFP的孢子可以沿著洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)行萌發(fā)和擴(kuò)展，但是其萌發(fā)的速率和菌絲擴(kuò)展的速度要比在棉葉表皮上慢。此外，菌絲不能侵入到洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)部。利用體視顯微鏡觀察V1070-GFP在水稻和玉米

6、根部的吸附情況，采用稀釋分離法對(duì)灌根處理的水稻和玉米根內(nèi)的V1070-GFP進(jìn)行分離。結(jié)果表明大麗輪枝菌不能吸附在玉米和水稻的根部，也未從根內(nèi)部分離出V1070-GFP。此外，我們還觀察了大麗輪枝菌V1070-GFP在水稻和玉米葉片上的侵染情況，發(fā)現(xiàn)V1070-GFP的孢子懸浮液大多呈滴狀吸附在葉片上，液滴不被葉片吸收且病原菌的孢子也不會(huì)萌發(fā)。極個(gè)別部位的孢子懸浮液被吸干，這些部位的孢子開始萌發(fā)但是菌絲不能進(jìn)入葉片內(nèi)部，也不會(huì)導(dǎo)致葉片產(chǎn)

7、生病斑。
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將綠色熒光蛋白基因sGFP導(dǎo)入落葉型大麗輪枝菌VD07038，將紅色熒光蛋白基因mCherryRFP導(dǎo)入非落葉型大麗輪枝菌Bp2中，分別獲得了具有綠色、紅色熒光信號(hào)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過分子驗(yàn)證和連續(xù)繼代培養(yǎng)，證明了這些轉(zhuǎn)化子具有遺傳穩(wěn)定的對(duì)潮霉素的抗性。通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度和致病力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子與野生型基本一致，少量轉(zhuǎn)化子發(fā)生變異。利用熒光顯微鏡觀察了轉(zhuǎn)化子VD0703

8、8G-10在感病棉花品種蘇棉22幼苗根部的侵染情況。發(fā)現(xiàn)在接菌12h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面;接種7-9 d后，菌絲入侵到棉花根部的維管組織。
　　本研究發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌可以侵染棉花幼苗的葉片，并通過系統(tǒng)擴(kuò)展到達(dá)莖部和根部，導(dǎo)致病癥的產(chǎn)生;受大麗輪枝菌侵染后，棉花葉片中會(huì)產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)來抵御病菌的侵染;大麗輪枝菌能夠在單子葉禾本科植物水稻和玉米葉片上萌發(fā)，但不能侵入葉片內(nèi)部，說明大麗輪枝菌與寄主之間存在某種識(shí)