蜂膠渣抑制桑青枯菌成分咖啡酸酯類化合物的酶促合成與生物活性.pdf

1、桑樹(shù)青枯病是由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡(jiǎn)稱青枯菌）引起的一種植物細(xì)菌病，具有發(fā)病急、蔓延迅速、危害嚴(yán)重、防治困難等特點(diǎn)，屬于對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)毀滅性危害的重要桑樹(shù)病害之一。當(dāng)前，桑青枯病的防治措施使用的藥劑多為化學(xué)農(nóng)藥，毒性較大，污染環(huán)境，有的已經(jīng)禁用，因此急需尋找毒性較小、環(huán)境友好和成本可控的新型生物農(nóng)藥制劑。自古以來(lái)，蜂膠的抗菌效果得到公認(rèn)，是蜂巢防病治蟲這一天然防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前，市場(chǎng)上的蜂膠

2、保健食品常以總黃酮含量作為產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因而蜂膠制品的工業(yè)化生產(chǎn)主要是提取其黃酮類成分，而具有抗菌活性的咖啡酸及其酯類衍生物則殘留在大量的蜂膠渣中，若加以利用開(kāi)發(fā)天然來(lái)源的農(nóng)藥制劑，則會(huì)變廢為寶，既節(jié)約了成本，又保護(hù)了環(huán)境，符合國(guó)家實(shí)施綠色植保戰(zhàn)略要求，具有重要的學(xué)術(shù)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，本課題擬從蜂膠渣中篩選出抑制青枯菌活性強(qiáng)的咖啡酸酯類單體，構(gòu)建新型雙液相酶促合成新工藝，比較分析敏感差異的病原菌全基因組，并探究對(duì)桑葉重要害蟲及天

3、敵的影響。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下：
　　（1）為尋找蜂膠渣中所含的抑菌活性成分，基于活性追蹤法，評(píng)價(jià)蜂膠渣按照溶劑極性制備的分級(jí)提取物對(duì)青枯菌五個(gè)生理小種的抑制效果，采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)對(duì)其含有的咖啡酸及其酯類化合物作定性定量分析，并結(jié)合藥效進(jìn)一步篩選出高活性單體化合物。結(jié)果表明，蜂膠渣的甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯以及石油醚等提取物對(duì)青枯菌的五個(gè)小種均有一定的抑菌活性，其中乙醇提取物活性高于其他。0.1 mg/mL的除蠟

4、蜂膠渣乙醇提取物對(duì)桑樹(shù)青枯病病原菌RS-5的抑菌率達(dá)91.61±4.75％。對(duì)蜂膠渣乙醇提取物應(yīng)用ESI-LC-MS技術(shù)，采用全掃描模式鑒別了咖啡酸及5種咖啡酸酯類化合物，采用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Selective Reaction Monitor, SRM）模式基于特征離子對(duì)測(cè)定了咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量。從咖啡酸及其6種酯類單體化合物中篩出MC（Methyl caffeate, MC）和咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phen

5、ethyl ester, CAPE）兩種單體，EC50值分別為310.0-1225.0μg/mL和165.2-752.7μg/mL，對(duì)病原菌的細(xì)胞產(chǎn)生了變形、破損等嚴(yán)重傷害，對(duì)其泳動(dòng)性和形成生物膜等病原傳播特性造成了極大控制，是潛在的桑青枯菌抑制劑，為研發(fā)天然來(lái)源的桑樹(shù)青枯病防控藥劑提供了新的思路。
　?。?）為提高底物溶解度和合成效率，應(yīng)用雙相催化的原理，通過(guò)添加氧膦類絡(luò)合劑營(yíng)造可逆的絡(luò)合萃取效應(yīng)，首次構(gòu)建―TOPO-環(huán)己烷/[

6、Bmim][Tf2N]‖體系，以強(qiáng)化脂肪酶催化MC與2-苯乙醇發(fā)生酯交換合成抑菌活性單體CAPE，解析絡(luò)合萃取強(qiáng)化酶促反應(yīng)分離耦合的過(guò)程機(jī)理，為高效生物合成咖啡酸酯類衍生物提供新工藝；為監(jiān)測(cè)連續(xù)流酶催化轉(zhuǎn)酯化合成過(guò)程中的底物MC和產(chǎn)物CAPE，實(shí)時(shí)表征連續(xù)流酶催化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用新型離子源的實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜技術(shù)（Direct Analysis in Real Time-Mass, DART-MS）建立了一種快速簡(jiǎn)便的定量新方法。結(jié)

7、果表明，三正辛基氧膦（Trioctylphosphine oxide, TOPO）為絡(luò)合劑，對(duì) MC和 CAPE等咖啡酸酯類單體具有高選擇性的可逆絡(luò)合反應(yīng)特性，構(gòu)建的TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf2N](1:1, v/v)雙相體系適用于Novozym435催化酯交換反應(yīng)合成 CAPE。通過(guò)響應(yīng)曲面分析法獲得最優(yōu)工藝條件，即在25 g/L TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf2N](1:1, v/v)中，MC濃度為10 g/L、2-

8、苯乙醇與MC的摩爾比為20:1、反應(yīng)溫度為76℃、TOPO濃度為25 g/L、時(shí)間為59 h時(shí)，MC的轉(zhuǎn)化率為98.83±0.76%，CAPE的得率為96.29±0.07%。其中，最適底物濃度提高了3.33倍；單位底物的催化劑用量減少了77.8%，降低了工藝成本。通過(guò)化學(xué)計(jì)量計(jì)算、紅外光譜和酶動(dòng)力學(xué)分析，證實(shí)TOPO和咖啡酸酯類單體之間的可逆性氫鍵締合效應(yīng)顯著增強(qiáng)了反應(yīng)分離耦合對(duì)脂肪酶催化反應(yīng)的協(xié)同作用。選擇負(fù)離子模式，通過(guò)優(yōu)化 DAR

9、T離子源的操作參數(shù)提高了檢測(cè)靈敏度，獲得了高質(zhì)量的質(zhì)譜，成功建立了生物催化體系中咖啡酸酯類組分的DART-MS檢測(cè)新方法，反應(yīng)物直接檢測(cè)，無(wú)需純化。使用DART-MS2測(cè)定由MC（母離子m/z192.87和子離子m/z133.44）和CAPE（母離子m/z282.93和子離子m/z178.87）產(chǎn)生的特定離子，根據(jù)SRM信號(hào)的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。在3.125~50 mg/L范圍內(nèi)獲得MC和CAPE的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)（R2）

10、分別為0.9515和0.9973，檢測(cè)限分別為0.005 mg/L和0.003 mg/L，定量限分別為0.02和0.01 mg/L，回收率范圍分別為92.50-97.11%和90.11-97.60%。使用DART-MS分析每個(gè)樣品約40秒，結(jié)果與常規(guī)高效液相色譜法一致，成功用于測(cè)定連續(xù)流填充床微反應(yīng)器中酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)和質(zhì)量傳遞系數(shù)。因此，雙相體系為強(qiáng)化酶促合成CAPE提供了新介質(zhì)，DART-MS為微流控生物催化動(dòng)力學(xué)表征提供了新手段。

11、
　?。?）為揭示青枯菌2個(gè)生理小種（GIM1.71和RS-5）對(duì)MC和CAPE的敏感性差異，利用比較基因組學(xué)的方法分析兩個(gè)小種間基因組結(jié)構(gòu)的差異，尋找可能導(dǎo)致耐藥性變化的特有基因，或序列結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的共有基因。采用目前最新的第三代測(cè)序技術(shù)，對(duì)GIM1.71和RS-5進(jìn)行了全基因組測(cè)序，分別獲得約3.8M的全基因組序列以及所包含的質(zhì)粒序列。通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)基因組中的編碼基因、重復(fù)序列和非編碼 RNA進(jìn)行了全面的注釋，共得到約5

12、200編碼基因和約70個(gè)非編碼RNA（包括sRNA和tRNA）。通過(guò)與Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，對(duì)編碼基因的功能進(jìn)行了注釋。通過(guò) KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，對(duì)編碼基因參與的生物學(xué)通路進(jìn)行了分析。通過(guò)對(duì)GIM1.71、RS-5和已報(bào)道GMI1000三個(gè)小種的比較，除三者共有的3833個(gè)基因外，共找到390個(gè)GIM1.71特有的基因和76個(gè)RS-5與GMI1000共有而GIM1.71缺失的基因。通過(guò)SNP、插入-缺失和基因組結(jié)構(gòu)變異

13、分析，在GIM1.71和RS-5基因組中，識(shí)別到了33,697個(gè)和44,368個(gè)SNP位點(diǎn)；對(duì)于三個(gè)小種共有基因，識(shí)別到了106個(gè)基因僅在GIM1.71小種中發(fā)生了小片段插入-缺失。這些發(fā)現(xiàn)將有助于揭示GIM1.71和RS-5之間對(duì)咖啡酸酯類單體敏感性的差異，為進(jìn)一步的深入分析提供了候選目標(biāo)。
　　（4）為探究MC對(duì)桑葉重要害蟲的抑制作用及天敵營(yíng)養(yǎng)級(jí)的影響，評(píng)價(jià)其作為桑葉害蟲新型害蟲抑制劑的開(kāi)發(fā)潛能，測(cè)定了MC對(duì)斜紋夜蛾、桑螟和斑

14、痣懸繭蜂適合度指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，1.0%和2.0%的MC對(duì)斜紋夜蛾和桑螟幼蟲均具有顯著的拒食作用，且斜紋夜蛾2齡幼蟲對(duì)1.0%和0.1%的MC溶液均存在取食選擇性。連續(xù)飼喂含2.0% MC的桑葉后，斜紋夜蛾幼蟲體重增長(zhǎng)顯著放緩，而取食含1.0%和2.0%的MC的桑葉7 d后，桑螟體重僅為對(duì)照組的37.67%和30.00%。隨著MC濃度的升高，斜紋夜蛾和桑螟幼蟲的存活時(shí)間均顯著縮短，取食2.0%MC溶液后，兩者存活時(shí)間分別比對(duì)照組縮短

15、了24.6%和57.38%。MC對(duì)斜紋夜蛾幼蟲化蛹率無(wú)顯著影響，但在1.0%和2.0%濃度下斜紋夜蛾羽化率顯著下降；取食1.0%和2.0%的MC后，桑螟化蛹率分別比對(duì)照組下降了60.94%和53.25%，羽化率也隨之下降。斑痣懸繭蜂寄生取食不同濃度MC的斜紋夜蛾后，子代壽命、子代體型大小等重要的適合度指標(biāo)均無(wú)顯著變化，僅在2.0%濃度處理下出繭數(shù)下降、子代蜂發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。因此，MC在三層營(yíng)養(yǎng)級(jí)關(guān)系中，對(duì)害蟲的抑制作用較大，對(duì)寄生性天敵的