peptide pull down 方案譯文

1、PeptidePulldown方案方案設計好的備用肽段（C端末尾加幾個殘基作為連接臂并且末端偶聯(lián)生物素，）應被色譜純化至純度大于80%，等分，凍干，干燥環(huán)境下于—80度儲存1連接肽段的珠子的制備連接肽段的珠子的制備：（注意，制備的所有步驟都應在冰上或最多4度的環(huán)境下進行）1用1mL磷酸鹽緩沖液加0.1%的表面活性劑TritonX100，沖洗400微升的親和素珠（離心？（microcentrifuge），500RCF，30s）移去上清液，

2、至少洗三次（洗去表面的保護劑，表面活性劑TritonX100也促使疏水性的珠子與水相分離，否則無法得到上清液）制備兩個400L的珠子，其中一份不偶聯(lián)肽段作為只有珠子的對照組。用裝有毛用裝有毛細管凝膠管凝膠的移液器尖端來取上清液，從而避免移去珠子的移液器尖端來取上清液，從而避免移去珠子2使100微克偶聯(lián)生物素的肽段重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液（PBS）中這些肽段的量足夠配400L偶聯(lián)肽段的珠子，做20次pull—down，如果珠子有著

3、不同的連接生物素能力，注意將肽段和親和素比例調(diào)整合適3將2中制備好的400微升重新懸浮的肽段加入400微升洗過的珠子中，旋轉(zhuǎn)（rotation），在室溫下溫育3到5h也可在4度過夜溫育4用1mLPBS0.1%TritonX100沖洗連接了肽段的珠子至少三次，來移除未連接上的肽段5將偶聯(lián)了肽的珠子重新懸浮在400微升磷酸鹽緩沖液中來制備50%的懸浮液，在4度下儲存若長期儲存，加疊氮化鈉到濃度為0.1%，4度下至少可儲存1個月。甲基化修飾穩(wěn)

4、定，磷酸化修飾不穩(wěn)定2用固定好的肽段從復雜混合物中釣蛋白用固定好的肽段從復雜混合物中釣蛋白一些一般原則：一些一般原則：復雜混合物與珠子的處理復雜混合物與珠子的處理5每份將80L（50%）的未偶聯(lián)的珠子溶液（含40L珠子），離心使成團（500RCF，30s），移除上清液6用500LBufferD(含濃度為150mM的KCl)將珠子至少洗一次（500RCF，30s，移去上清液，避免移走珠子）7將制備的核提取物加到洗過的珠子中，在4度下輕輕旋

5、轉(zhuǎn)（rotation）溫育30分鐘若方便可以增加溫育時間，然而預清理時間在超過30分后，我們再沒能觀察到非特異性連接蛋白背景水平的下降。而且請記住這步不能從數(shù)量上減少非特異性連接的水平（只作為對照組）8通過離心30秒使珠子集聚成團狀（離心力調(diào)整為500RCF），用干凈試管收集上清液來用于pulldown如果需要的話，再離心除去任何殘余珠子9取15uL清澈的核提取物作為input對照組用于之后的分析偶聯(lián)肽段珠子的準備偶聯(lián)肽段珠子的準備10

6、每份取40uL50%的珠子懸浮液（含20uL珠子）偶聯(lián)肽段的珠子的量可以根據(jù)蛋白與它結合的親和力的強弱來調(diào)整，然而我們也發(fā)現(xiàn)當珠子體積超過20uL只能增加背景干擾水平，不能增加特異性連接11離心使珠子集聚成團狀，移除所有上清液，保證每份有著大致相同量的珠子通過離心30秒使珠子集聚成團狀（離心力調(diào)整為500RCF），用裝毛細管凝膠的移液管吸頭移去上清液，，在每次pulldown試驗中確保使用大致相同的已偶聯(lián)肽段的珠子是很重要的，確保不同肽