利用GST Pull-down在鰭斑青鳉中篩選與Pod1相互作用的蛋白質.pdf

1、Pod1作為真核細胞中重要的轉錄因子—bHLH轉錄因子家族中蛋白質，既能特異識別并結合DNA非編碼序列調節(jié)下游基因的表達，也能與其他蛋白質相互協(xié)同參與哺乳動物性腺發(fā)育，腎臟、肺、脾臟、心臟等主要器官的形成，以及腫瘤抑制、機體免疫等多種生命調控。本研究以作者發(fā)現(xiàn)的中國魚類新紀錄種—鰭斑青鳉為實驗動物，篩選與Pod1相互作用的蛋白質進而推測其可能的功能，研究的主要內容及結果如下:
　　(1)利用日本青鳉的序列信息設計出酶切位點修飾引物

2、，從鰭斑青鳉性腺組織中擴增出pod1、sf1、bmp4、妒和hdac1、arα、arβ7個基因編碼區(qū)片段，克隆至pEASY-T5 Zero載體，并測序得到驗證。
　　(2)將克隆至T載體的7個基因編碼區(qū)片段，通過限制性核酸內切酶酶切，T4 DNA連接酶重新連接，成功構建出7種重組原核表達質粒pET32a(+)-pod1和pGEX5X1-sf1/bmp4/tcf3/hdac1/ara/arβ，并雙酶切及測序得到驗證。
　　(3

3、)將7種重組原核表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)、OrigamiB(DE3)四種宿主菌株內，在不同的IPTG誘導劑濃度、誘導溫度、搖床轉速、誘導時間等條件下誘導表達，篩選出最佳的誘導條件，并用6His和GST標簽單克隆抗體通過Western blot驗證了所表達的融合蛋白。
　　(4)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色分析表明，Pod1融合蛋白獲得很好的表達效果，幾

4、乎都是可溶的活性蛋白且占總蛋白的50％以上，包涵體蛋白質極少;而Sf1、Bmp4、Tcf3、Hdac1四種融合蛋白表達形式以可溶性蛋白為主，目的蛋白與宿主菌自身蛋白質相比條帶最亮;此外，Arα、Arβ兩種蛋白質在多種誘導條件下都沒有獲得好的表達效果，Western blot顯示它們沒有表達。
　　(5)使用Ni-NTA樹脂從細菌裂解液中得到純化的Pod1融合蛋白，再用Millipore超濾離心管脫鹽處理后充當Prey蛋白，分別與結