藥物分析供試品前處理與測(cè)定方法效能指標(biāo)

1、第四章 樣品前處理與分析方法驗(yàn)證,§1. 定量分析樣品的前處理方法 1. 概述,含鹵素藥物,,與芳環(huán)連接,牢固；與脂肪鏈C連接,不牢固。,含金屬 藥物,,金屬鹽或配位化合物,如酒石酸銻鉀等,不牢固；金屬原子直接與碳原子結(jié)合,如卡巴胂,牢固。,2. 不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 (1)直接測(cè)定法：金屬原子不直接與碳原子相連，如富馬酸亞鐵； (2)直接回流后水解測(cè)定法： 含鹵素藥物 +NaOH?回

2、流?間接銀量法測(cè)定(加過(guò)量AgNO3再用　NH4SCN返滴定),(3)硫酸水解后測(cè)定法(4) 氧化還原后測(cè)定法　a. 堿性還原后測(cè)定法，如泛影酸的測(cè)定,Na I + AgNO3 ? AgI? +NaNO3,+NaI,b. 酸性還原后測(cè)定法，如碘番酸的測(cè)定　碘番酸 +HAc +Zn? I- ? 銀量法測(cè)定,c. 汞齊化法：,,d. 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測(cè)定含量,3. 經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法,4. HNO3-HClO4

3、 法,適用于血、尿、組織等,4. HNO3-H2SO4 法,不適用于含堿土金屬有機(jī)藥物,3. H2SO4 -硫酸鹽法,含砷、銻有機(jī)藥物,2. 灼燒（干法） ? 420 0C,1. 氧瓶燃燒法,不適用于含易揮發(fā)性金屬有機(jī)藥物,氧瓶燃燒法,,? 硬質(zhì)瓶(測(cè)F時(shí)用石英瓶)? 稱樣? 先通氧氣后點(diǎn)火? 吸收液(H2O或H2O+NaOH等),碘苯酯,I2(I-),I-,,IO3-,I2,,S2O32- 滴定,三氯叔丁醇,膽影酸,

4、泛影酸,碘他拉酸,碘番酸,碘苯酯,鹽酸胺碘酮,諾氟沙星,醋酸氟輕松,磺溴酞鈉,葡萄糖酸銻鈉,富馬酸亞鐵,酒石酸銻鉀,汞撒利,卡巴胂,§2. 生物樣品分析的前處理技術(shù),目的：,(1) 藥物進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體 液、組織和排泄物中除了游離型藥物之外，還有藥物的代謝物、 藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物、以及藥物或其代謝物與內(nèi)源性物 質(zhì) (如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯綴

5、合物)等 多種形式存在，需要分離后測(cè)定藥物及代謝物；(2) 生物樣品的介質(zhì)組成比較復(fù)雜，主要影響是蛋白質(zhì)。,,1. 常用樣品的種類、采集和貯藏 1. 血樣?血漿的制備：將采取的血液置含有抗凝劑(肝素、草酸鹽、枸櫞酸鹽、 EDTA、氟化鈉等)的試管中，混合后，以2500?3000rpm 離心5mi

6、n使與血細(xì)胞分離，分取上清液即得。,?血清的制備：將采取的血樣在室溫下至少放置30min到1hr，待凝結(jié) 出血餅后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕地剝?nèi)パ灒缓?以2000 ?3000rpm離心分離5 ? 10min，分取上清液即 得。,藥

7、物結(jié)合型,游離型,,,,不能通過(guò)血管壁,保存：,4 0C,-20 0C,(1) 唾液,由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔粘膜內(nèi)許多散在的小腺體分泌液混合組成。,? 1.003?1.008 pH 6.2?7.6,,? 不受時(shí)間、地點(diǎn)限制，可反復(fù)采集? 無(wú)痛苦、無(wú)危險(xiǎn)? 有些唾液中藥物濃度可以反映血漿 中游離型藥物濃度,(2) 尿液,采集方式,,,隨時(shí)尿晨尿白天尿夜間尿時(shí)

8、間尿,自然排尿,,立即測(cè)定，超過(guò)24hr應(yīng)加防腐劑(苯、甲苯、醋酸、濃HCl),2. 生物樣品分析前處理技術(shù) 根據(jù)生物樣品的類型進(jìn)行分離、純化。如血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放；唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白；尿液樣品常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出，當(dāng)原型藥物排泄在尿中時(shí)，可簡(jiǎn)單地用水稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行測(cè)定。,? 樣品處理步驟與分析方法的選擇,(1) 去除蛋白質(zhì)：,a. 加入與水相混溶的有機(jī)溶劑

9、，如乙睛、甲醇、乙醇、 丙醇、丙酮、四氫呋喃，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間 的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合 的藥物釋放出來(lái)； b. 加入中性鹽，使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，使蛋白 質(zhì)脫水而沉淀，如飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷 酸鹽及枸櫞酸鹽等；,c. 加入強(qiáng)酸，使蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀，如 10%三氯醋酸，6%高氯酸、硫酸-鎢酸混合液及5% 偏磷酸等； d. 加入

10、含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑，分取上清液，如 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等； e. 酶解法：加蛋白水解酶中的枯草菌溶素，既可使組 織酶解，又可使藥物析出。,(2) 綴合物的水解：尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài) 酸水解（HCl） 酶水解(葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶

11、),,(3) 分離、純化與濃集： a. 液-液提取法(乙醚或氯仿) b. 液-固提取法(小規(guī)模的柱色譜法，用青 水性硅藻土和疏水性活性炭、聚苯乙烯等),(4) 化學(xué)衍生化： a. 使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；

12、 b. 提高檢測(cè)的靈敏度； c. 增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性； d. 提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力。,§3. 測(cè)定方法的效能指標(biāo),(1) 精密度(Precision):,測(cè)定同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值彼此符合程度,衡量方法,,批內(nèi)精密度 ? 5%

13、批間精密度 ? 15%,(2) 準(zhǔn)確度(Accuracy)：測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度,,,85 ?115%(樣品濃度?200?g/l)80 ?120%(樣品濃度?200?g/l),(3) 檢測(cè)限(Limit of Detection): 指分析方法能夠從背景信號(hào)中區(qū)分 出藥物時(shí)，所需樣品中藥物的最低

14、 濃度，無(wú)需定量測(cè)定。,LOD,(4) 定量限(Limit of Quantitation): 指在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn) 確度和精密度)的前提下，分析方

15、 法能夠測(cè)定出的樣品中藥物的最 低濃度。,LOQ,(5) 選擇性(Selectivity):,指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時(shí)該分析方法對(duì)供試物質(zhì)準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。,? 專屬性,一種方法僅對(duì)一種分析成分產(chǎn)

16、生唯一信號(hào)；選擇性則可對(duì)多種化學(xué)成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，而主要成分的響應(yīng)可與其他響應(yīng)區(qū)分。,● 線性與范圍(Linearity and Range): (6) 線性：在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的 試驗(yàn)結(jié)果的 能力 (7) 范圍：利用同一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果， 而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小

17、量之 間的間隔，可用 mg/l ? mg/ l或 ?g/l ? ?g/l 表示。 Y=a+bx r?0.9900,● 重現(xiàn)性(再現(xiàn)性) (Ruggedness):,不同人、不同實(shí)驗(yàn)室、不同儀器，共同對(duì)同一樣品的某物理量進(jìn)行反復(fù)測(cè)量，其結(jié)果接近的程度,,? 重復(fù)性,同一人、同一實(shí)驗(yàn)室、同一儀器，對(duì)同一樣品反復(fù)測(cè)量，測(cè)

18、量值之間接近的程度。,評(píng)價(jià)其保持不受參數(shù)微小變化影響的能力，并可作為正常使用的一個(gè)可靠性指標(biāo)。,(8) 耐用性(粗放度)(Robustness):,● 與參比方法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度的比較：,? 要求：r ? 0.95 b 1,藥典要求的檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容,思考題,1. 以三氯叔丁醇為例說(shuō)明加熱回流水解法的原理和方法, 加熱回流水解法適用于哪一類含鹵素有機(jī)藥物的測(cè)定?2. 什么是氧瓶燃燒法？在