pcr擴增原理及操作

1、1PCR擴增反應的操作第一節(jié)PCR擴增反應的基本原理一、聚合酶鏈式反應（一、聚合酶鏈式反應（PCR）的基本構成）的基本構成PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱，指在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術，在分子生物學中有廣泛的應用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學等。PCR基本原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3’末端有引物存

2、在的情況下，用酶進行互補鏈的延伸，多次反復的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴增。在微量離心管中，加入與待擴增的DNA片段兩端已知序列分別互補的兩個引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱TaqDNA聚合酶、Mg2等。反應時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài)；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在TaqDNA聚合酶的催化下

3、，以dNTP為原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應的模板，如此重復改變溫度，由高溫變性、低溫復性和適溫延伸組成一個周期，反復循環(huán)，使目的基因得以迅速擴增。因此PCR循環(huán)過程為三部分構成：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當溫度下催化DNA鏈延伸合成（見圖）。1模板DNA的變性模板DNA加熱到90~95℃時，雙螺旋結構的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性，以便它與引物結合，為下輪反

4、應作準備。變性溫度與DNA中GC含量有關，GC間由三個氫鍵連接，而AT間只有兩個氫鍵相連，所以GC含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結構的復雜性、GC含量高低等均有關。對于高GC含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97℃，時間適當延長，即所謂的熱啟動。2模板DNA與引物的退火將反應混合物溫度降低至37~65℃時，

5、寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板引物復合物。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為1～2min。3引物的延伸DNA模板引物復合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復

6、制原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。重復循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。在72℃條件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個堿基秒。經(jīng)過一輪“變性退火延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個循環(huán)需2～4min，一次PCR經(jīng)過

7、30～40次循環(huán)，約2～3h。擴增初期，擴增的量呈直線上升，但是當引物、模板、聚合酶達到一定比值時，酶的催化反應趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺效應”，即靶DNA產物的濃度不再增加。PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA擴增量可用Y＝（1＋X）n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應3二、

8、二、PCR反應的五個元素反應的五個元素參與PCR反應的物質主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg2。1引物引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構，再次引物不能在模板的非目

9、的位點引發(fā)DNA聚合反應（即錯配）。引物的選擇將決定PCR產物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產量有關的重要物理參數(shù)。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNAPCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量：若使用設計粗糙的引物，產物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數(shù)期的產量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化，比如調整Mg2濃度，使用特

10、殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。（1）引物長度PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為1530bp，常用的是18～27bp，但不應大于38bp。引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應的最適溫度，還會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反

11、應，而且合成長引物還會大大增加合成費用。（2）引物堿基構成引物的GC含量以40～60%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5～10℃。若按公式Tm=4（GC）2（AT）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有

12、聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。（3）引物二級結構引物二級結構包括引物自身二聚體、發(fā)卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應控制其ΔG大于5.0kcalmol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結構，也以3’端

13、或近3’端對引物模板結合影響更大；影響發(fā)卡結構的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發(fā)卡結構的引物。（4）引物3’端序列引物3’末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別