基因操作原理

1、第三章 分子克隆載體,,,Molecular cloning vectors,將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（host cell）的工具稱為載體,載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1．在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）,2．必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制,3．有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選,其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備,利用重組DNA技術(shù)分離目的基因，稱之為基因克隆,克隆動(dòng)詞：指從單一祖先產(chǎn)生同一的D

2、NA分子群體或細(xì)胞群體的過(guò)程,名詞：指從一個(gè)共同祖先無(wú)性繁殖下來(lái)的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體。,載體的類(lèi)型：質(zhì)粒plasmid 噬菌體phage 粘粒載體cosmid 噬菌粒phagemid,由大量的含有基因DNA（即某一生物的全部DNA順序）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫(kù)引自《分子生物學(xué)》，閻龍飛、張玉麟主編， 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993,一 、質(zhì)粒的基本特性

3、,第一節(jié) 質(zhì)粒載體Plasmid vectors,1．概念① 染色體外的遺傳因子，能進(jìn)行自我復(fù)制 （但依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)）② 大多數(shù)為雙鏈，閉環(huán)DNA分子，少數(shù)為線性③ 大小1kb～200kb,也有更大,質(zhì)粒的表型: 抗生素的抗性、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物 產(chǎn)生毒素（如大腸桿菌素，腸毒素），限制酶與修飾酶、固氮、殺蟲(chóng)等,復(fù)制子有不同的組成方式（滾環(huán)、?、以及G+/G-）在Ecoli中，使用的大多數(shù)載體都帶有

4、一個(gè)來(lái)源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復(fù)制子其復(fù)制方式如下：,,,,,,,RNAII,,ori,,-550,,,,600,400,Rop,RNAI,,RNase H,2．質(zhì)粒的復(fù)制① 復(fù)制起始區(qū): 通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū),合成RNAII即前引物，形成雜交體RNaseH 切割RNAII 使之成熟，形成三葉草結(jié)構(gòu)RNAI 可控制RNAII形成二級(jí)結(jié)構(gòu)Rop增強(qiáng)RNAI的作用,② 拷貝數(shù)

5、嚴(yán)謹(jǐn)型：拷貝數(shù)有限，大約1～幾個(gè)構(gòu)馳型：拷貝數(shù)轉(zhuǎn)多，幾十至幾百,削弱RNAI和RNAII之間相互作用的突變，將含增加帶有pMB1或(ColE1)復(fù)制子的拷貝數(shù)，(突變位置位于rop基因或編碼RNAI和RNAII的復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)),,RNAI的起點(diǎn)上游1個(gè)核苷酸G變成了A，從而使得其轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)改為下游3個(gè)核苷酸處(由于RNAI 5’單鏈的完整對(duì)于RNA/RNAII間的相互作用至關(guān)重要因此，pUC質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加看來(lái)很可能是由于)縮短的R

6、NAI與RNAII的結(jié)合效率降低所致,pMB1質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的產(chǎn)物, 因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進(jìn)行，復(fù)制依然能夠我行我素,當(dāng)存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有pMB1(或ColE1)復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中

7、可積聚2-3千個(gè)質(zhì)粒。,3．質(zhì)粒的不相容性 兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時(shí)，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復(fù)制系統(tǒng)，質(zhì)粒分配到子細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小差異，最終放大。不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)不相容群，ColE1/pMB1 pSC101, p15A,4．轉(zhuǎn)移性

8、在自然條件下，很多質(zhì)粒可以通過(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)要素：移動(dòng)基因mob，轉(zhuǎn)移基因tra，轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)如：F’質(zhì)粒pBR322有起始位點(diǎn)bom的nic位點(diǎn)，可在第三個(gè)質(zhì)粒（如ColK）編碼的轉(zhuǎn)移蛋白作用下，通過(guò)接合性質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。但大多數(shù)載體無(wú)nic/bom位點(diǎn)（pUC）,1. 選擇標(biāo)記用于鑒別目標(biāo)DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的宿主挑選出來(lái),二 、標(biāo)記基因,(1) 氨芐青霉素抗性基因AmpR ampr a

9、mpicillin青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合, 抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并抑制其活性AmpR編碼一個(gè)酶，可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，并催化?-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性,青霉素是一類(lèi)化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA中有一個(gè)孢和的噻噬環(huán)（A）和一個(gè)?-內(nèi)酰胺環(huán)，6-APA由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽,(2) 四環(huán)素抗性基因 tetr

10、 tetracycline與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位tetr基因編碼一個(gè)由399aa組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。,(3) 氯霉素抗性基因 chloramphenicol, Cmr or CatCm與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成目前使用的Cmr來(lái)源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性P1噬菌體(也攜帶 Tn9)cat基因編碼一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白(每個(gè)亞基23kDa)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，在乙酰輔

11、酶A存在的條件下，催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的形成，該產(chǎn)物不能與核糖體結(jié)合,該酶的表達(dá)對(duì)分解代射的產(chǎn)物敏感，若細(xì)菌利用除葡萄糖以外的碳源生長(zhǎng)時(shí)，其表達(dá)量可增加到原來(lái)的5-10倍，在cAMP/ 分解代射的產(chǎn)物基因激活蛋白存在下，依賴于DNA的RNA聚合酶在體外與cat基因啟動(dòng)子結(jié)合的能力明顯增強(qiáng)。,(4) 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanamycin/neomycin可與核糖體成分相結(jié)合并抑制

12、蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉胺氮基糖苷這兩種抗生素可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH(3’)-II）所滅活，該酶為25kDa，似乎位于外周質(zhì)腔，這些抗生素的磷酸化干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。,(5) Sup F 琥珀突變抑制基因終止密碼：UAA(赭石), UAG(琥珀), UGA(乳白), supF編碼細(xì)菌的抑制性tRNA在某一宿主中含具琥珀突變的tetr 和ampr，只有當(dāng)含supF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入

13、后，宿主才會(huì)對(duì)Amp和tet具抗性，supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨 如 ? AN13 , 0.895kb,(6) 其它 正向選擇標(biāo)記質(zhì)?？杀磉_(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活,2. 篩選標(biāo)記,(1) ?-互補(bǔ)----- ? complementation LacZ’基因的互補(bǔ),?-galactosidase 1024aa,,,,,LacZ,LacZ△M

14、15,LacZ’,,,140個(gè)aa,編碼缺失第11-41位氨基酸,140個(gè)aa + MCS,,,,,IPTG:異丙基-?-D-硫代半乳糖苷 誘導(dǎo)物X- gal: 5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷 底物 (生色劑),?-半乳糖苷酶分解x-gal 形成藍(lán)色產(chǎn)物,,MCS : Multiple cloning sites,,LacZ△M15,LacZ’,IPTG/x-gal,LacZ△

15、M15LacZ’,,藍(lán)色,LacZ△M15LacZ’? DNA,IPTG/x-gal,,白色,在載體中加入一個(gè)短區(qū)段，含LacZ基因的調(diào)控區(qū)和頭140個(gè)aa的編碼信息，在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞閱讀框架，相當(dāng)于在?-半乳糖苷酶的氨基端插入了幾個(gè)氨基酸，而不影響未加幾個(gè)氨基酸時(shí)的功能。lacz?M15 編碼缺失第11-41位氨基酸的?-半乳糖苷酶，但無(wú)酶學(xué)活性。,當(dāng)lacZ’與lacz?M15的產(chǎn)生混合在一起時(shí)卻

16、有酶學(xué)活性，所以在載體上加lacZ/(MSC)，并在受體菌中引入lacz?M15即可實(shí)現(xiàn)?-互補(bǔ)。,在生色底物（x-gal）存在下形成蘭色菌落，而外源基因插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)?-互補(bǔ)能力的氨基端片段。,?-互補(bǔ)lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的?-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),,,LacZ△M15 放在F質(zhì)粒上, 隨宿主傳代LacZ’

17、 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記,(2) 插入失活,相應(yīng)的受體菌 TG1, XL1-Blue , JM101等,? (lac-proAB)F’[proAB+ lacIq lacZ ?M15],lacI: LacZ阻抑物的編碼基因（lacIq突變使阻抑物產(chǎn)量增加）,三、質(zhì)粒載體的種類(lèi)① pBR322之前pSC101,ColE1等, 大且酶切位點(diǎn)少轉(zhuǎn)化效率與大小成反比 >15kb 轉(zhuǎn)化效率成為限制因素質(zhì)粒越大

18、，越難于用限制酶切因素進(jìn)行鑒定質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)就越低,② pBR322以后，調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)，提高載體的效率 pBR322 pUC質(zhì)粒去掉多余片段，提供多克隆位點(diǎn)，篩選標(biāo)記③ 增加輔助功能/表達(dá)載體，穿梭載體,1．克隆載體用于擴(kuò)增or 保存DNA片段，最簡(jiǎn)單的載體① pBR3224361bp， 許多質(zhì)粒載體由此發(fā)展而來(lái)，GenBank V01119, J01749 (4361bp)含有30多個(gè)單一位點(diǎn)，且

19、Ampr和tetr可通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選,,Ap,,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

20、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

21、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

22、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

24、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,Ap,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

25、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

26、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,② pUC18/192686bp 18: L08752 19:X02514來(lái)自pBR32

27、2其中LacZ’(MSC)來(lái)自M13mp18/19 MSC (10個(gè)位點(diǎn)), ?-互補(bǔ)cloning: expression: 利用lacZ promotersequencing: Universal and Reserve primer 引物位置/引物序列,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Multiple cloning sites,ForwardUniversal primer,Reverse primer,

28、,,③ pUC118/119 118: UO7649 3162bp // 119: UO7650 3162bp 帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列，當(dāng)含這些質(zhì)粒的細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時(shí)，可合成質(zhì)粒DNA的其中一條鏈，并包裝子代噬菌體顆粒用途:分離ssDNA 測(cè)序，誘變，探針,噬菌粒,④ 體外轉(zhuǎn)錄 pGEM-3Z/4Z 3Z：X65304 4Z：X65

29、305 2.74kb,⑤ 綜合性載體pTZ18/19/U/R pTZ18U L37352(2860bp) 1994pTZ18R L08956 (2871bp) 1993pTZ19R Y14835 (2862bp) 2019 L08957 (2870bp) 1994pTZ19U Y14836(2862bp) 2019 L37382 (2863bp) 1994pGEM-3Zf 3197bppGE

30、M-3Zf(-) X65307 pGEM-3Zf(+)X65306,Bluescript M13 (2958bp)SK(-) X52324 / SK(+) X52325KS(-) X52326 / KS(+) X52331(2961bp)II SK(+) X52328 / II SK(-) X52330II KS(+) X52327 / II KS(-) X52329,e.g p

31、Bluescript II KS(+),載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1．在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）2．必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制3．有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選4．其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備,,,,附加因素: MSC, LacZ’(?-互補(bǔ)), ssDNA phage origin, Promoters,2. 表達(dá)載體p35s-

32、GFP(U 28417, 4518bp)等,第二節(jié) ? phage vectors,1.最早使用的克隆載體 并對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)作了深入研究2.為利用該載體必須熟知其分子生物學(xué)，了解載體的設(shè)計(jì)和組建的原則,一、?噬菌體的分子生物學(xué)48502 bp GenBank J02459 or M172335’strand overhangs the 3’ strand by 12 basesGGGCG

33、GCGACCT,,,,? / HindIII(7 個(gè)切點(diǎn))23.1 (kb) 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 564 (bp) 125,? 48502bp,,（一）?發(fā)育調(diào)節(jié)1. 吸附 37℃正常，室溫?zé)o噬斑2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期,裂解溶原,?噬菌體生活史簡(jiǎn)圖,,,,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,? DNA,Phage particle,lys

34、is,DNA replication,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Integration/excision,reconbination,Late control,Phage particle,lysis,DNA replication,Controlregion,

35、Integration/excision,reconbination,Late control,2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期N：正調(diào)節(jié)子使PL和RR繼續(xù)轉(zhuǎn)錄(中和σ-因子的活性)Cro：抑制PL和PR，使積累的Q蛋白引導(dǎo)晚期轉(zhuǎn)錄cII：引導(dǎo)cI表達(dá)（PE）cIII：引導(dǎo)int表達(dá)（PI）cI：全面抑制并阻斷表達(dá) ( 與QR和OL結(jié)合),Cro/cII的優(yōu)勢(shì)，引入不同途徑 宿主/?基因產(chǎn)物的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡正常情

36、況下：Cro/cII各自起作用的機(jī)會(huì)大致相當(dāng)，并受外部條件的影響,在延遲早期結(jié)束時(shí)，下一步生長(zhǎng)所需的蛋白才會(huì)表達(dá)出來(lái)，不可逆地朝裂解循環(huán)或溶原循環(huán)方向發(fā)展,Wild type E. coli ，向溶原和裂解的轉(zhuǎn)變由感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection) 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)決定的感染復(fù)數(shù)越高，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)越差溶原化(lysogenization)的頻率就越高,溶原現(xiàn)象的生化媒介可能是 3’-5’cAMP

37、,細(xì)胞內(nèi)的濃度會(huì)隨營(yíng)養(yǎng)條件的變化而改變當(dāng)細(xì)胞富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是，cAMP的濃度較低，有利于裂解生長(zhǎng)在缺乏cAMP的突變細(xì)胞中，更有利于裂解生長(zhǎng)由于不知道哪個(gè)噬菌體的啟動(dòng)子受cAMP的調(diào)節(jié)，因此溶原和裂解的選擇部分受到細(xì)菌基因或調(diào)節(jié)cAMP的基因,3．進(jìn)入裂解周期通過(guò)?復(fù)制，大約合成50個(gè)噬菌體基因組單體，然后進(jìn)入滾環(huán)復(fù)制。通過(guò)復(fù)制，產(chǎn)生基因組DNA的多聯(lián)體(concatemer)，最后被切割并被包裝到噬菌體顆粒中

38、recB/recC/ recD 產(chǎn)物, 外切核酸酶V 抑制DNA ?復(fù)制向滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)變gam可與外切核酸酶V結(jié)合,使之失活,Nul 和 A 蛋白與cosL/cosR結(jié)合在FI蛋白下DNA被纏入前頭中A基因產(chǎn)物的ter功能在cos R/cos L切割 S, R, Rz基因產(chǎn)物, 為裂解必須,Sam7該突變可防止或延遲裂解,?噬菌體的包裝,4．溶原化 只有cI, 及rexA rexB rexC表達(dá)

39、cI：236aa cI，cII，cIII發(fā)生突變不能溶原化cIts857：對(duì)熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變45℃失活誘導(dǎo)因素：如DNA損傷劑（UV）則RecA降解cI,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,,,正常,切離,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,,不正常切離,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,? 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成,,?d,,,,,?dgal,（二）?的可取代區(qū)1. 區(qū)域溶源化?的正確切

40、離→正常?不正確切離→不正常? gal替換 or bio替換J基因與Cro基因之間的丟失 不影響裂解生長(zhǎng)（約1/3）,2. 大小60%區(qū)域?yàn)楸仨?20kb (A→J ) 8-10kb 78～105% 包裝范圍37.831～50.927 可插入9-23kb,二、?噬菌體的選擇標(biāo)記1. 大小2. LacZ基因 在填充

41、片段中帶有?-半乳糖苷酶基因片段3. cI失活見(jiàn)?gt10,4．Spi篩選Spi+：? 不能感染 E.coli(P2)Spi-：?(red- gam-)能感染E.coli (P2) 形成小噬斑 host recA+ chi位點(diǎn),· ? 包裝時(shí)若gam-，需recA產(chǎn)物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑),所以對(duì)宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/

42、gam+可在recA-受體菌中增殖。Charon 32-35, 40·red- gam-時(shí)，若外源插入片段含chi位點(diǎn)(8bp),則形成清亮噬斑，否則形成小噬斑，由于chi位點(diǎn)的未知性，因此重組體可形成大小不等的噬斑為避免此問(wèn)題則在載體中加入chi位點(diǎn),如?2019, ?DASH, ?F1X,EMBL系列,三、代表性?噬菌體載體插入型載體 insertion vectors置換型載體 replacement

43、vectors,?噬菌體載體主要用于構(gòu)建基因文庫(kù)，特別是cDNA文庫(kù)。,（一）插入型載體1．?gt10載體 43340bp 插入大小 設(shè)計(jì)為6kb，理論7.6kbatt及其左側(cè)缺失(b527)，以及N基因至 cII基因之間的突變只在相當(dāng)于 cI基因內(nèi)有一個(gè) EcoRI位點(diǎn)。用于克隆小的(～6kb)cDNA而設(shè)計(jì)，外源DNA量有限時(shí)較好，克隆效率高,宿主菌：C600(BNN93)增殖載體 supE hsdR(rk

44、-) C600 hflA (BNN102)篩選重組體cI- 在hflA(高頻溶源化)中形成噬斑cI+ 在hflA中形成溶源，產(chǎn)生混濁噬斑， cI+ 的生長(zhǎng)受到宿主的抑制50～100倍,2．?gt11 插入型 插入大?。?～7.2kb 在最左側(cè)替代區(qū)置換一段lac5基因，其編碼區(qū)終止密碼子之前有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)（53bp上游）篩選：在lac

45、-宿主菌中，非重組噬菌斑為蘭色(IPTG) 用途：構(gòu)建cDNA文庫(kù)，基因組文庫(kù)，表達(dá)融合蛋白表達(dá)：表達(dá)融合蛋白，外源DNA片段有可能與lacZ的閱讀框相吻合，可用免疫學(xué)方法篩選,Sam100: supF突變,防止細(xì)菌裂解cI：溫敏突變 用來(lái)控制噬菌體的復(fù)制和融合蛋白的表達(dá),宿主：Y1090(hsdR) lon蛋白酶陰性 supF lac-, 可用于抗體或核酸探針篩選 增殖

46、載體， supF抑制Sam100 Y1089(hsdR) 具有高頻溶源特性 lon蛋白酶陰性， 表達(dá)外源蛋白,3. ?GEM-2/4?GEM-2: 43.80kb (0～7.1kb)?GEM-4: 46.2kb (0～4.7kb)同?gt10 ,在cI位點(diǎn)有差異,由EcoRI改位多克隆位點(diǎn),,,,,,,SpeI XbaI SacI

47、 EcoRI SpeI,,,SP6 T7,,,,,,,SpeI XbaI SacI EcoRI SpeI,,,SP6 AmpR T7,,pGEM-1,4: ?ZAP II

48、與?gt11 相似, 插入pBluescript M13 質(zhì)粒41kb, 0-10kb,Infected by helper phageI--T region will be packaged as a filamentous phagepBluescript plasmids are recovered by infecting an F' strain (AmpR),單個(gè)?噬菌體或擴(kuò)增的文庫(kù)與絲狀常助噬菌體共感染E.c

49、oli在細(xì)胞內(nèi)，幫助噬菌體中的蛋白(基因II蛋白)識(shí)別f1噬菌體正鏈合成起始(I)和終止(T)信號(hào)，并在相應(yīng)位置處切割，在help phage的作用下，切割下來(lái)的片段會(huì)環(huán)化，被包裝、分泌至細(xì)胞外；再感染F菌株，在AmpR下可獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒。Help phage：M13， ExAssist help phage,5. ?Excell 45.5kb,在E.coli NP66中于attL和attR之間發(fā)生同源重組，產(chǎn)生質(zhì)粒

50、pExCell (4190bp)外源DNA插入的大小 6kb 用于cDNA克隆,,,,,,cos,cos,,,AttL AttR,pExCell,? ExCell 載體釋放出質(zhì)粒的原理圖,了解?ZAP11和?ExCell目的在于了解有關(guān)的構(gòu)建原理進(jìn)一步領(lǐng)會(huì)如何利用生物的基本特征來(lái)構(gòu)建載體，即對(duì)生物的或DNA的某一特征加以利用，為以后的工作提供一種思維方法,（二）置換型載體,,,,

51、,,,cos,cos,R,L,Central stuffer,雜合片段: 含?DNA和其它DNA外源，來(lái)自E.coli 或動(dòng)物,Vector L arm stuffer R arm insertCharon 4A 19.5kb EcoRI/14.7kb 11kb 7～20kb lac5 XbaI/作插入型

52、 0～6kb,,,,,,,,,,E X E E,lac5,Vector L arm stuffer R arm insertCharon32 19.5kb EcoRI/12.5kb 11.9 8-19kb 小鼠DNA內(nèi)有4個(gè) EcoRI位點(diǎn)

53、 20kb HindIII置換 13.3 5～18kb 27kb SacI插入 16.8kb 0～10kb,,,,,,,,,,,,,,,E E E E E E,H3 Sac H3,EMBL 3/4,L 20kb R 9kb 9-23kb Spi篩選 prom

54、ega 19.9kb 8.8kb 7-20kb Mol Cloning,,,,,,,,SalI BamHI EcoRI,EcoRI BamHI SalI,14kb,Charon 40 stuffer containing 235bp repeats 約80copy (lac操縱基因+腺病毒DNA) 內(nèi)含XmaIII/XmaIII/NaeI 左右各16個(gè)

55、位點(diǎn)(MCS)用于切開(kāi)stuffer insert: 9.2～24.2kb,,,,,,,,,,,MCS,MCS,(XmaIII/XmaIII/NaeI)80,?DASH,9-22kb chi+利于染色體步查,,,,,,,,Xba Sal E B H Sac Xho Xba,,,,,,,,,,T3,T7,結(jié)構(gòu)同EMBL 3,?GEM-11 9-23kb chi+ (同EMBL/3/4臂),四、

56、克隆原理及步驟 結(jié)合?包裝過(guò)程1．通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體 回收、純化載體2．酶切、載體與外源DNA3．連接4．包裝 5．感染/鋪平板6．篩選,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,包裝感染鋪平板篩選,,陽(yáng)性克隆,,基因文庫(kù)(Lambda),,,9-23kb,Sau3A1,BamHI,連接,N=ln(1-p)/ln(1-f),P: 文庫(kù)中出現(xiàn)陽(yáng)性克隆的期望值F: 插入

57、片段占總DNA的比值,哺乳動(dòng)物 3x10917kb 99%,N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105,載體與外源片段的連接,去磷酸化回收載體臂部分補(bǔ)平酶切方式（雙酶切，重復(fù)片段）,一、粘粒的結(jié)構(gòu)特征1．粘粒實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，帶有將DNA包裝到?噬菌體顆粒中所需的DNA序列(cos序列)2．組成：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1）,抗性標(biāo)記ampr cos位點(diǎn)，能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化,

58、增殖3．大?。阂话?kb左右，可克隆38～47kb片段 包括?（38～52kb）,第三節(jié) 粘粒載體 cosmid,N=ln(1-p)/ln(1-f),P: 文庫(kù)中出現(xiàn)陽(yáng)性克隆的期望值F: 插入片段占總DNA的比值,哺乳動(dòng)物 3x10917kb 99%,N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105,二、克隆原理及步驟1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源

59、DNA與兩個(gè)粘粒相連，且cos方向相同3．體外包裝 在?的A蛋白的ter功能作用下切割cos位點(diǎn)并將其中的DNA包裝到成熟的?噬菌體顆粒中去4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細(xì)胞并通過(guò)cos位點(diǎn)的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制,三、用途1．在構(gòu)建基因文庫(kù)中，減少文庫(kù)中重組體的數(shù)目2．在單個(gè)重組體中克隆和增殖完整的（較大的）真核基因 雞前?2膠原、鼠三氫葉酸還原酶（DHFR）至少40kb ?載體最大

60、24kb，質(zhì)粒載體雖可攜帶大片段，但轉(zhuǎn)化率低。3．克隆與分析組成某一基因家族的真核DNA區(qū)段如哺乳動(dòng)物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有數(shù)十萬(wàn)個(gè)bp（幾百kb）,在“步查”過(guò)程中，粘粒具有優(yōu)勢(shì)，是?文庫(kù)的兩倍，粘?？煽寺?5kb,染色體步查：chromosome walking采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作為探針以鑒定含有相鄰序列的重組克隆。,,,,,,,,,,,Sau3A1,,,,,,,,,,,

61、,,,,,,,,,,,,,,四、粘?？寺≥d體1．pJB8 簡(jiǎn)單粘粒組成: amp ori cos 4個(gè)位點(diǎn)5.4kb 可容納33-46.5kb外源DNA片段對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化理，否則易形成多聯(lián)載體定向克隆,,,,,,,,,,,,,,,,,,包裝感染鋪平板篩選,,陽(yáng)性克隆,,基因文庫(kù)(E.coli),,33-46kb,Sau3A1,連接,,,,,

62、,,,,,,,,,,,BamHI酶切CIP去磷酸,mcs,COS,2 c2RB6.8kb 含兩個(gè)cos位點(diǎn) ampr kamr ori ColE1 4個(gè)E位點(diǎn)35～45kb35～45kb (MobI/經(jīng)CIP處理)一般高濃度ATP存在下（5mmol/L）抑制平端連接，但對(duì)粘端沒(méi)有影響包裝 感染 篩選,3．pCOS1 EMBL用于篩選體內(nèi)重組的重組粘粒文庫(kù)① 構(gòu)建文庫(kù)② 在recA-中增

63、殖（體內(nèi)包裝）③ 用?顆粒感染recA+E.coli（pUC18∷探針）④ 發(fā)生重組⑤ 再次包裝⑥ 再次感染，但recA- E.coli(ampr, kamr),,Ori/R6K,Ori/ColE1,Amp probe,,4．卡隆粒9載體系列為克隆33kb以下片段而設(shè)計(jì)SalI cos MCS amp ori pBR重復(fù)單元 SalI9個(gè)位點(diǎn) AvaI (2047bp)n

64、 AvaI在recA-穩(wěn)定,可用于增殖 1-23個(gè)串聯(lián)重復(fù)pBR322中2kb片段（含tet’）MCS: 9個(gè)酶切位點(diǎn)在recA+ E.coli 中可發(fā)生重排用于克隆33kb-2kb，如克隆經(jīng)Southern雜交確定的特定基因組DNA片段.,*：重復(fù)單元中含SalI位點(diǎn)，載體中也有一個(gè)SalI，當(dāng)用SalI消化時(shí)可將絕大多數(shù)重復(fù)片段去掉前提：外源DNA不含SalI,由于SalI識(shí)別GTCGAC，但哺乳動(dòng)物DNA CG序列

65、較少，100kb才能有一個(gè)SalI位點(diǎn),MluI: ACGCGT哺乳動(dòng)物中平均500kb一次PvuI: CGATCG 300kb一次用于制作限制性酶切圖譜 如 先MluI消化, 再用不切割重復(fù)片段的酶部分切割,5．pWE15,五、文庫(kù)的擴(kuò)增和貯存,1. 濾膜影印 25%甘油 TB平板, -70 ?C,2. 混菌保存 混合單菌落, 15%甘油, -7

66、0 ?C,3. 體內(nèi)包裝 重組缺陷?超感染, 重新包裝重組cosmid, 收集裂解混合物, 在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中, 4?C可貯存幾年, 或含7%二甲基亞砜(DMSO) -70 ?C長(zhǎng)期保存,生長(zhǎng)平衡問(wèn)題,六、常見(jiàn)問(wèn)題自我連接、多個(gè)外源插入等問(wèn)題已解決但仍不足以作為常規(guī)克隆，不如?phage,1．基因組DNA質(zhì)量，開(kāi)始超過(guò)200kb2．酶解受到抑制，須梯度離心3．無(wú)外源DNA，單個(gè)cos → 5%空

67、，雙cos低得多 charomid 高→ 20%4．重組質(zhì)?？截悢?shù)差異大5．盡管文庫(kù)似乎全面，但也許不能獲得目的克隆，限制酶位點(diǎn)的非隨機(jī)分布，污染限制酶，重組缺失,擴(kuò)增時(shí)目的克隆可能被淘汰。,第四節(jié) 單鏈絲狀噬菌體載體,包括M13 ,f1, fdM13為 6.4kb (6407 base), ssDNA組織形式相同，顆粒大小，形狀相近, DNA同源高，98%差異位于第三密碼子, 互補(bǔ)

68、活躍，彼此間易重組視為等同,一、M13的生物學(xué)1．結(jié)構(gòu)6407bp 90% 編碼蛋白11個(gè)編碼基因間隔區(qū)小大間隔區(qū)位于VIII/III 和 II/IV，其間有表 達(dá)調(diào)控元件,6-7nmx880nm,IG：intergenic region, or IR 非編碼區(qū)，但不是非必需區(qū)，508bp含：對(duì)包裝及DNA在病毒顆粒中的定向 進(jìn)行調(diào)控的順式作用信號(hào)，正鏈與負(fù)鏈DNA合成起始和終止位點(diǎn)，以