elisa原理--操作規(guī)則新手適用

1、ELISA原理－－操作規(guī)則（新手適用）酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA一實驗?zāi)康拿嘎?lián)免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosbentassay簡稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體(抗原)再加相應(yīng)酶標記抗體(抗原)生成抗原(抗體)待測抗體(抗原)酶標記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反

2、應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。二實驗原理用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。辣根過氧化物酶

3、（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A(1cm403nm1%)＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mgml，所以，酶濃度以mgml計算是HRP的A(1cm403nmmgml=2.5)HRP純度(RZ)=A403

4、nmA275nm純度RZ（ＲeinheitZahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。ELISA的基本原理有三條：（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙基本方法二用于檢測未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。↓加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.

5、1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中置37℃孵育1小時洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)↓于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育3060分鐘，洗滌最后一遍用DDW洗滌?！溆嗖襟E同“雙抗體夾心法”的4、5、6。（二）酶與底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。免疫技術(shù)