病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

1、病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,,病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法,病原學(xué)診斷 病毒分離培養(yǎng)顯微鏡檢查抗原檢測核酸檢測血清學(xué)診斷 抗體檢測 IgM、IgG,一、標(biāo)本采集與運(yùn)送,（一）標(biāo)本采集采集時(shí)間：盡早采集（越早越好）標(biāo)本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇,（二）標(biāo)本的運(yùn)送與保存,1.低溫送檢 4℃可保存數(shù)小時(shí)-70℃可長期保存 -10 ～ -20℃下病毒易滅活，不可用于保存病毒標(biāo)本對冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融2.保濕

2、送檢50%甘油鹽水保存送檢 病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hank’s液3.無菌送檢 抑制細(xì)菌生長 100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素 抑制真菌生長 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素,二、病毒的分離與鑒定,（一）病毒分離和鑒定的一般程序,（二）病毒的分離,組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種,1.組織培養(yǎng),將人或動(dòng)物離體的活組織

3、或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術(shù)。組織培養(yǎng)的類型（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng) 人胚氣管－呼吸道病毒；人胚腸－腸道病毒（3）細(xì)胞培養(yǎng) 最常用原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) 二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物新鮮組織（人胚腎等）→胰酶消化→營養(yǎng)液培養(yǎng)→單層細(xì)胞（原代細(xì)胞） 原代細(xì)胞→胰酶消化→轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細(xì)胞） 對病毒敏感，但制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只能傳2～3代。二倍體細(xì)胞株 原代細(xì)胞

4、反復(fù)傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞系 來源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。,原代和次代培養(yǎng)細(xì)胞,2. 雞胚培養(yǎng),常用于粘病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)接種途徑及方法 新鮮受精卵 接種病毒,,38～39℃7～13d,卵黃囊接種羊膜腔接種

5、尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種,,絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷,3. 動(dòng)物接種,常用動(dòng)物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病對動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射流感病毒 鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清,（三）病毒的鑒定,病毒的初步鑒定動(dòng)物感

6、染范圍及潛伏期對雞胚的敏感性在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)理化性質(zhì)的測定最后鑒定血清學(xué)鑒定: 中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等分離的新病毒，必須進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定,病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn),（1）細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化） 正常細(xì)胞代謝： 培養(yǎng)液由紅變黃 病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅,,病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，這種由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)變化，稱為細(xì)胞病變

7、效應(yīng)。,（2）細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect ，CPE）,細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。 某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE,,,（3）空斑現(xiàn)象,空斑（plaque）是指在單層細(xì)胞中，由活細(xì)胞包圍的由病毒感染引起的死細(xì)胞的區(qū)域。一個(gè)空斑由一個(gè)病毒顆粒感染 所致，利用空斑可純化病毒。 不同種類病毒形成 的空斑大小和形狀不同，可用于鑒定病毒。,（4） 干擾現(xiàn)象當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)或先

8、后感染同一細(xì)胞時(shí)，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現(xiàn)象。,（5）紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn),受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞 如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽性,（6）血凝及血凝抑制試驗(yàn),含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗(yàn)，可用于分型。,病毒

9、的理化性質(zhì)測定,主要用于新發(fā)現(xiàn)病毒的鑒定（1）病毒的大小及形態(tài) 電鏡直接觀察（2）核酸類型 5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）能抑制DNA復(fù)制，而不抑制RNA病毒。（3）乙醚敏感試驗(yàn) 有包膜病毒對乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸試驗(yàn) 腸道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活,病毒的血清學(xué)鑒定,中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等,

10、三、病毒的血清學(xué)診斷,單份血清IgM測定 早期診斷雙份血清IgG測定 4倍以上增長，有診斷意義,病毒血清學(xué)試驗(yàn)常用方法,（一）中和試驗(yàn) 原理 抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感細(xì)胞的能力 一定量抗體可中和一定量病毒。 中和試驗(yàn)的必要條件： 1. 活病毒 2. 敏感細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物,中和試驗(yàn)的常用方法：固定V.，稀釋血清，測定抗體效價(jià) （常用）固定血清

11、，稀釋V.，求中和指數(shù)中和試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)特異，敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。既可用細(xì)胞培養(yǎng)做，也可用動(dòng)物或雞胚接種，以細(xì)胞最常用。檢測IgG，不能用于早期診斷，常用用于流行病學(xué)調(diào)查。,（二）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),檢測IgM，常用于早期診斷。不需活細(xì)胞，比中和試驗(yàn)簡單，省時(shí)。（三）IF及ELISA方法簡單、快速、敏感性高。,四、病毒感染的快速診斷,（一）病毒的形態(tài)學(xué)檢查 1.光學(xué)顯微鏡檢查

12、病變組織中找包涵體。 簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體,,2. 電鏡及免疫電鏡檢查,直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（＞106/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測）,乙型肝炎病毒電鏡圖,輪狀病毒電鏡圖,（二）病毒抗原檢查,用免疫標(biāo)記技術(shù)檢測： DFA、IFA、IEA等可檢測細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。,I