棉蘭染色張健東

1、,,,,,,,,,,,,,,,,真菌真菌鏡檢染色- 乳酸棉蘭酚染色,天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 張健東,真菌標(biāo)本的接種培養(yǎng)基選擇常用染色方法曲霉菌屬鏡下形態(tài)和菌落特點(diǎn)病例分析,,醫(yī)學(xué)重要的霉菌分類,,合格痰標(biāo)本,,含1-2種不同細(xì)菌，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果可根據(jù)病情再作分析超過3種細(xì)菌，按不合格標(biāo)本處理。,中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,23(5):312,真菌標(biāo)本的接種,,呼吸道標(biāo)本,肺泡灌洗液,無菌體液： （腦脊

2、液、穿刺液、骨髓、玻璃體等）,無菌體液1-5ml打入真菌/分枝桿菌血培養(yǎng)瓶,三區(qū)劃線28℃孵箱，5天培養(yǎng)基用封口膜密封好懷疑生長緩慢菌（如組織胞漿菌），延長培養(yǎng)時間至30天。懷疑真菌生長，點(diǎn)種,真菌培養(yǎng)宜使用含和不含抗菌藥物的兩類培養(yǎng)基。經(jīng)空氣傳播有高度感染性的真菌樣品、含菌絲體的真菌應(yīng)在生物安全柜內(nèi)處理。若采用平皿培養(yǎng)，應(yīng)封蓋。,CNAS-CL42：2012,培養(yǎng)基選擇,,沙保羅培養(yǎng)基SDA,,馬鈴薯培養(yǎng)基PDA,,CHR

3、OMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基,菌落形態(tài)（菌落大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地）顯微鏡下真菌孢子、菌絲、產(chǎn)孢等特征性結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步判斷真菌種屬。遇到疑難的絲狀真菌，應(yīng)請專業(yè)組內(nèi)多名技術(shù)人員觀看、討論，以確定種屬。每次觀察的菌落特征均需要記錄、并照下顯微鏡下的形態(tài)特征和菌落。參考圖譜或網(wǎng)上咨詢,真菌培養(yǎng)物形態(tài)學(xué)鑒定,菌落形態(tài) 觀察,酵母型菌落類酵母型菌落絲狀型菌落（正、反）雙相真菌,顯微鏡檢查,有隔或無隔分支或不分支有色或無色,

4、形態(tài)學(xué)鑒定,常見顯微鏡檢查方法,KOH壓片法（直接鏡檢）墨汁染色乳酸酚棉蘭染色六胺銀染色革蘭染色： 回顧性看有利于診斷,顯微鏡檢查方法,KOH壓片：皮屑、毛發(fā)、指甲、膿液、痰等標(biāo)本置于載玻片上，加一滴10-20% KOH，蓋上蓋玻片鏡檢，加熱30-60s，鏡檢先低倍后高倍（在KOH中加入剛果紅1:1，更有利于真菌檢測）,墨汁染色：以無菌吸管吸取處理過的標(biāo)本一滴置于玻片上，再加上一小滴印度墨汁混合均勻，以40°角蓋上蓋

5、玻片(避免產(chǎn)生氣泡)鏡檢（樣本與墨汁等量混合）,顯微鏡檢查方法,顯微鏡檢查方法,乳酸酚棉蘭染色：通常采用透明膠帶法利用膠帶先粘一定量菌絲再粘在預(yù)先滴加乳酸酚棉蘭的載玻片上顯微鏡下觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、大小和排列等。,六胺銀染色涂片（痰需消化，無菌液體離心）甲醇固定后自然風(fēng)干過碘酸滴染10分鐘，溶液用后棄去流水沖洗（3遍）65℃銀溶染液1h-1.5h染色時間根據(jù)涂片的厚度所懷疑真菌的種類，通常念珠菌染色1h即可，疑為曲

6、霉或者其他絲狀真菌須適當(dāng)延長染色時間（銀溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，只用一次）流水沖洗（3遍）0.25%的氯化金染1到2分鐘（可重復(fù)使用）流水沖洗3%的硫代硫酸鈉染1分鐘流水沖洗0.1%的亮綠染色30秒到1分鐘 目的使得到一個背景色,顯微鏡檢查方法,菌體的包囊壁呈黑色,,曲霉菌鏡下形態(tài)特點(diǎn),,菌絲體形態(tài)曲霉菌絲有隔膜，為多細(xì)胞霉菌。分枝 （ 45℃角）有分枝足細(xì)胞分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形。,煙曲霉菌落特

7、點(diǎn),培養(yǎng)特性：生長快45℃仍可生長開始為白色2-3日后轉(zhuǎn)為藍(lán)綠色背面無色或黃褐色表面粉末狀,煙曲霉菌落, PDA, 25℃, 7d,鏡下形態(tài),分生孢子頭短粗型，梗光滑，4/5小梗覆蓋，倒立燒瓶狀頂囊，頂囊有單層小梗小分生孢子呈球形，綠色，有小刺,鏡下形態(tài),,足細(xì)胞,,頂囊,18,鑒別要點(diǎn),45℃生長良好，菌落呈藍(lán)綠色頂囊呈燒瓶狀，小梗為單層，與雙層的土曲霉，雜色曲霉，構(gòu)巢曲霉相區(qū)別頂囊單層和雙層兩種瓶梗的黃曲霉和

8、黑曲霉鑒別，藍(lán)綠色可與綠曲霉和棒曲霉鑒別,形態(tài)學(xué)觀察,? 黃曲霉菌落特征－生長快－孢子黃色－表面粉末狀,黑曲霉菌落特征,生長快 PDA培養(yǎng)基菌落初為白色繼而黑色背面無色或中央略褐色厚絨狀氣生菌絲多,鏡下形態(tài),分生孢子頭疏松放射狀，梗無色，小梗為單層，雙層，或單雙層同時生于一個頂囊，成放射狀小分生孢子呈球形或梨形，表面粗糙,鏡下形態(tài),,分生孢子*400,,分生孢子*1000,鑒別要點(diǎn),頂囊有單層和雙層瓶梗，可與

9、煙曲霉，土曲霉以及雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉相鑒別。分生孢子梗光滑，無色至褐色，菌落初為白繼而黑色，可與黃曲霉鑒別。,形態(tài)學(xué)觀察,土曲霉菌落特征－生長快－菌落圓形－孢子淡棕色或棕色,形態(tài)學(xué)觀察,構(gòu)巢曲霉綠色，淺黃到黃色（正面）紫紅色到橄欖色（背面）頂囊（半球形或燒瓶狀）小梗 雙層，第一層略長孢子 (球形，粗糙，成鏈排列),形態(tài)學(xué)觀察,雜色曲霉菌落特征菌落生長慢緊密、圓形絨毛狀到羊毛狀顏色數(shù)種，從青綠到紅綠

10、,曲霉菌形態(tài)特點(diǎn),青霉屬,培養(yǎng)特性橘青霉PDA培養(yǎng)基上25-28℃生長較快，菌落表面呈絨狀，少數(shù)為絮狀，表面為藍(lán)色或灰綠色，背面黃色至橙色。繩狀青霉表面白色至粉色，有時有藍(lán)綠色 區(qū)域。馬爾尼菲青霉初為灰白色蠟樣，膜狀平坦 菌落，逐漸變成淡黃，黃綠色，背面紅色2周左右表面呈淡紅色絨毛狀，整個培養(yǎng)基被染成玫瑰紅色,菌落特點(diǎn),鏡下形態(tài),分生孢子梗大多從基質(zhì)長出，或氣生菌絲生長，每個梗基上簇生6-10個平行而略密的小梗，形成特征

11、性的帚狀枝。,臨床意義,橘青霉可引起腎臟的損害，有弱致癌性；繩狀青霉可引起大米變質(zhì)并引起中毒；馬爾尼菲青霉引起皮膚結(jié)節(jié)，皮下膿腫及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)感染，預(yù)后兇險(xiǎn)。,鏈格孢屬,培養(yǎng)特性SDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，生長迅速，形成棉絮狀，后變?yōu)榫G褐色至深褐色，背面為黑色。,鏡下形態(tài),——分生孢子梗直立，暗色，分隔，單生或分枝狀。分生孢子磚格狀，倒棍棒狀，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形分隔。,臨床意義,鏈格孢可引起皮下組織膿腫和潰瘍，還可

12、引起足菌腫。,病例分析,現(xiàn)病史女，78歲，天津東麗區(qū)人，患者因反復(fù)咳嗽咳痰、憋喘十余年加重5天、神志不清1天入院。入院5天前出現(xiàn)咳嗽咳痰加重，痰液呈黃粘狀不易咳出，于當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院就診，給予平喘消炎治療（消炎藥未知）未見好轉(zhuǎn)，喘息加重。1天前神志不清，我院急診查血?dú)?，顯示II型呼衰，進(jìn)行器官插管，收入ICU。,病例分析,既往史長期吸煙史、糖尿病史、高血壓史，長期使用“野藥”（可疑激素）史。,病例分析,入院檢查體溫37.2℃，昏迷、對光

13、反射消失，雙肺呼吸音粗，可聞及干濕性羅音，心率24 BPM，血壓無法測出；白細(xì)胞12.42*109/L，PCT 7.66 ng/ml，微生物動態(tài)真菌監(jiān)測41.45 ng/ml。肺炎支原體培養(yǎng)陽性，痰培養(yǎng)為多重耐藥鮑曼不動桿菌肺CT提示：雙肺下葉炎性病變，考慮右肺中葉膨脹不全，雙肺間質(zhì)性改變，雙肺肺氣腫，雙肺索條狀及鈣化點(diǎn)。,病例分析,病例分析,治療及轉(zhuǎn)歸給予阿奇霉素和舒普深治療，同時使用甲強(qiáng)龍擴(kuò)張氣道平喘，不排除肺真菌感染的可能性

14、，繼續(xù)行痰培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)檢查3月27日真菌培養(yǎng)結(jié)果為煙曲霉，加伏立康唑治療。3月30日，患者氣道痙攣較前好轉(zhuǎn)，喘憋減輕。3月31日，PCT 1.03ng/ml，患者氣道痙攣明顯好轉(zhuǎn)，喘憋減輕，適當(dāng)下調(diào)呼吸機(jī)條件，雙肺呼吸音低，可聞少量濕羅音。,病例分析,培養(yǎng)基,鏡下形態(tài),病例分析,治療及轉(zhuǎn)歸4月12日，脫機(jī)；4月17日，兩次痰真菌培養(yǎng)陰性，微生物動態(tài)真菌監(jiān)測陰性，伏立康唑用足療程，決定停藥；4月22日，脫機(jī)9日，患者COPD

15、，但不能脫離無創(chuàng)機(jī)械通氣輔助，提示預(yù)后不良，家屬拒絕再次插管；4月25日，患者自動出院。,病例分析,病例分析,分析患者入院痰培養(yǎng)提示多重耐藥鮑曼不動桿菌，給予舒普深治療；后真菌培養(yǎng)提示煙曲霉感染，給予伏立康唑治療后，病人病情明顯好轉(zhuǎn)；繼續(xù)行痰培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)檢測，痰培養(yǎng)依舊提示鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌；考慮應(yīng)用舒普深導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)逆行入患者氣道內(nèi)所產(chǎn)生的感染，并非患者侵襲性肺病的根本病原菌。,病例分析二,現(xiàn)病史女，65歲，河

16、北省定州市人，入院前一周感咳嗽，為黃色黏痰，伴憋氣，伴雙下肢水腫，伴皮膚黏膜黃染加重，伴尿色加深，于2015年5月13日收入我院肝內(nèi)病區(qū)。既往史患者自身免疫性肝硬化病史，曾行食道靜脈曲張?zhí)自委?，低蛋白血癥，膽紅素明顯增高，肝功能儲備差，應(yīng)用激素治療。入院檢查肝病面容，皮膚鞏膜重度黃染，體溫36.0℃，白細(xì)胞9.16*109/L ，中性粒細(xì)胞百分比92.0%，HB 105g/L，PCT 0.35ng/ml。,病例分析,治療與轉(zhuǎn)歸

17、5月14日，體溫37℃，咳嗽咳痰，行痰培養(yǎng)檢查；5月15日，胸片提示：雙下肺紋理增粗；患者長期服用激素，免疫力低下，易合并感染，考慮肺炎，給予拜福樂抗感染治療；5月20日，患者體溫38.2℃，咳嗽、咳痰、痰中帶血，CT提示雙肺多發(fā)結(jié)節(jié)影及團(tuán)片狀致密影。,病例分析,5月21日，送檢痰培養(yǎng)；5月22日，痰培養(yǎng)回報(bào)懷疑曲霉菌感染，遂請呼吸科會診，不排除曲霉菌感染，送檢痰真菌培養(yǎng)，并加用伏立康唑。5月25日，葡聚糖105.70 pg/