小鼠骨髓染色體制備及觀察

1、實(shí)驗(yàn)三 小白鼠骨髓染色體制備及觀察,1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求⑴ 掌握動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體制備技術(shù) ⑵ 學(xué)會(huì)動(dòng)物細(xì)胞的滴片方法 ⑶ 觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征和染色體數(shù)目,2、實(shí)驗(yàn)原理,⑴ 小鼠骨髓細(xì)胞⑵ 秋水仙素可破壞骨髓細(xì)胞分裂過程中紡錘體的形成，把分裂細(xì)胞阻截在中期。⑶ 通過對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的低滲、固定、滴片、染色等處理，可觀察到小鼠染色體。⑷ 這種骨髓染色體制片方法簡單，取材容易，不需無菌條件，方便易行。,3、實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2、健康小鼠(Mus musculus 2n=40)，體重約18～20g，雌雄不限。 試劑 甲醇、冰乙酸、石炭酸品紅、秋水仙素、KCl、生理鹽水,3、實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)器材恒溫培養(yǎng)箱、普通離心機(jī)、顯微鏡、分析天平、離心管(5～10 mL)、吸管注射器(5 mL)、100 mL燒杯、載玻片 （冰片）,3、實(shí)驗(yàn)材料,溶液配制：(1)0.01％秋水仙素：稱10 mg秋水仙素，溶于100 mL生理鹽水中。(2)低滲溶液：稱5.59克KCl

3、溶于1,000 mL蒸餾水中，其濃度為0.075M。2%檸檬酸鈉溶液：：稱2.28克檸檬酸鈉溶于100ml蒸餾水中。Giemsa溶液,4、實(shí)驗(yàn)方法,主要實(shí)驗(yàn)步驟⑴ 秋水仙素注射⑵ 解剖小鼠⑶ 離心⑷ 低滲⑸ 固定⑹ 制備細(xì)胞懸浮液⑺ 滴片⑻ 空氣干燥 ⑼ 染色 ⑽ 水洗 ⑾ 顯微鏡觀察結(jié)果,方法與步驟,取材前3～4 h，向腹腔內(nèi)注射秋水仙素。注射濃度隨動(dòng)物種類不同而異。秋水仙素的主要作用是使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分

4、裂中期，增加中期分裂相的比例。,腹腔內(nèi)注射秋水仙素3~4小時(shí)后，斷頭處死小鼠。,取出小鼠的后肢骨，注意不要將股骨剪斷，否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。,滴加適量生理鹽水進(jìn)行沖洗，并仔細(xì)地將皮膚、肌肉等組織清除干凈。,加入適量低滲液，用剪刀將骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓細(xì)胞全部釋放出來。,亦可用注射器抽取檸檬酸銨溶液沖洗骨髓，效果佳,將獲得的液體收集到離心管中，離心后去上清液，加低滲液至8ml左右，室溫下靜置20~30分鐘，進(jìn)行低滲。低

5、滲結(jié)束后，加入1ml左右的Carnoy’s固定液進(jìn)行預(yù)固定，輕輕混勻后，離心。,1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清，加入固定液，混勻后，室溫放置25分鐘，再次離心去上清，重復(fù)固定一次，離心后，向沉淀中加入1ml固定液，將細(xì)胞重懸。,,,,預(yù)冷的玻片,滴片后，將片子晾干，滴加適量Giemsa染液染色10~15分鐘，棄去染液，水洗，鏡檢。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,苯酚品紅染色效果,結(jié)果顯示,在顯微鏡尋找分散良好的中期分裂相。小白鼠染色體一般呈“U”形，

6、都為近端著絲粒染色體。染色體數(shù)2n=40。圖示為吉姆薩染色效果,5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論,繪制小鼠骨髓細(xì)胞染色體圖 統(tǒng)計(jì)小鼠染色體數(shù)目如果有條件時(shí)，要進(jìn)行顯微攝影，然后進(jìn)行組型分析,使用檸檬酸鈉的原因： 在臨床上采取新鮮血液時(shí),需要加入一些消毒過的檸檬酸鈉,就能起到防止血液凝固的作用,所以檸檬酸鈉被稱為抗凝血?jiǎng)?枸櫞酸根與血中鈣離子形成難解離的絡(luò)合物，鈣離子是凝血過程中所需的物質(zhì)之一，血液中鈣離子減少，而使血液凝固受阻。,

7、低滲的作用： 低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液，例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀（0.65M）、氯化鉀（0.075M）等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，同時(shí)可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個(gè)平面上觀察所有染色體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中一般選用0.075M KCl為低滲液（具體情況取決于實(shí)際操作），其優(yōu)點(diǎn)有：①染色體輪廓清楚，可染色性