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文檔簡介
1、銻(Antimony, Sb)是劇毒類金屬,與同主族的砷(Arsenic,As)有很多相似的理化性質(zhì)。由于銻的廣泛應(yīng)用、銻礦的開采以及銻化物的大量生產(chǎn)使銻污染問題日益嚴峻,嚴重危害人類健康。銻氧化型細菌可將毒性強的三價銻類物質(zhì)[Antimonite,Sb(Ⅲ)]氧化為毒性弱的五價銻[Antimonate,Sb(Ⅴ)]類,降低銻對細菌和環(huán)境的毒性。因此,研究細菌中的銻代謝、鑒定新型銻氧化酶、闡明銻氧化機制對環(huán)境銻循環(huán)和銻污染治理均具有重要
2、意義。近年來國際國內(nèi)學者對銻轉(zhuǎn)化的研究日漸重視,但在本人碩士研究開始之前(2012年),微生物Sb(Ⅲ)氧化的分子機制仍是空白。本研究團隊近年來發(fā)現(xiàn)了多種異養(yǎng)型銻氧化細菌,本論文以異養(yǎng)型砷/銻氧化菌Agrobacteriumtumefaciens GW4為材料,研究了銻氧化及能量代謝機制,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
1.首次發(fā)現(xiàn)了以NADP+為輔酶的Sb(Ⅲ)氧化酶AnoA。通過前期蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)氧化還原酶AnoA在Sb(Ⅲ
3、)條件下表達量上調(diào);熒光定量和報告基因融合的方法證實anoA基因的轉(zhuǎn)錄受不同濃度Sb(Ⅲ)的誘導;基因的同框缺失敲除、互補及超表達實驗證明anoA與菌株的Sb(Ⅲ)表型密切相關(guān);缺失anoA基因使Sb(Ⅲ)氧化速率(下降~27%)及抗性下降,互補株表型回復,超表達anoA使Sb(Ⅲ)氧化速率升高~34%;表達純化AnoA蛋白進行體外酶反應(yīng)動力學實驗,結(jié)果表明AnoA能夠在體外以NADP+為輔酶直接催化Sb(Ⅲ)的氧化,Km為64±10μ
4、M,Vmax為150±7nmolmin-1 mg-1;此外,由于砷、銻結(jié)構(gòu)的相似性,AnoA還能夠在體外催化As(Ⅲ)的氧化,但AnoA與底物As(Ⅲ)的親和力以及酶反應(yīng)速率均不如Sb(Ⅲ);在E.coli中異源表達AnoA能夠顯著提高菌株Sb(Ⅲ)的氧化速率。以上結(jié)果表明AnoA為細菌體內(nèi)新型Sb(Ⅲ)氧化酶,但細菌中仍然存在著其它氧化Sb(Ⅲ)的因子。
2.闡明了細胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2能夠作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)至Sb(
5、Ⅴ)。Sb(Ⅲ)能夠誘導細胞產(chǎn)生氧化壓力從而產(chǎn)生大量H2O2;能夠?qū)2O2分解為H2O和O2的過氧化氫酶基因katA受不同濃度Sb(Ⅲ)和H2O2的誘導且在菌株對Sb(Ⅲ)和H2O2的抗性中起重要作用;敲除katA基因后,菌株GW4-ΔkatA的氧化速率顯著加快,且細胞內(nèi)H2O2含量顯著增加,互補株表型回復;在細菌體內(nèi),隨著細胞的生長,H2O2含量逐漸下降,而Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量逐漸升高(R2=0.93,P<0.05),
6、說明細菌體內(nèi)逐漸減少的H2O2用于氧化Sb(Ⅲ);在培養(yǎng)基中,Sb(Ⅲ)過量的條件下,添加的H2O2濃度越高,Sb(Ⅲ)氧化生成的Sb(Ⅴ)含量越多,呈正相關(guān)(R2=0.94,P<0.05)。以上結(jié)果表明Sb(Ⅲ)誘導產(chǎn)生的氧化壓力與菌株對Sb(Ⅲ)氧化及抗性密切相關(guān),胞內(nèi)H2O2作為非酶促因子氧化Sb(Ⅲ)能夠同時降低Sb(Ⅲ)和氧化壓力對細胞的毒害,是細菌中一種重要的“以毒攻毒”的機制。
3.鑒定了砷氧化酶AioAB在菌株
7、GW4的Sb(Ⅲ)氧化過程中的作用。砷氧化酶AioAB能夠在細胞周質(zhì)氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)。前期研究表明AioAB在A.tumefaciens5A中也能夠催化Sb(Ⅲ)的氧化,aioA基因的缺失使菌株5A的Sb(Ⅲ)氧化速率下降。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在A.tumefaciens GW4中敲除aioA基因后菌株GW4的氧化速率加快;熒光定量PCR結(jié)果表明這是由于aioA基因的缺失能使銻氧化酶基因anoA和過氧化氫酶基因katA上調(diào)表達;
8、此外,加銻條件下突變株GW4-ΔaioA細胞內(nèi)H2O2含量也比野生型明顯增加,互補株的表型回復,說明缺失aioA后細胞內(nèi)AnoA催化的酶促和H2O2介導的Sb(Ⅲ)氧化均會上調(diào)。以上結(jié)果表明AioAB在菌株GW4中作用并不顯著,但通過影響AnoA和KatA的表達來參與銻氧化。
4.闡明了菌株GW4中Sb(Ⅲ)和砷氧化酶AioAB對銻響應(yīng)代謝途徑和能量產(chǎn)生的影響。通過前期蛋白質(zhì)組學研究結(jié)合基因的轉(zhuǎn)錄和代謝通路分析,發(fā)現(xiàn)Sb(Ⅲ)
9、能夠誘導菌株GW4和突變株GW4-ΔaioA中Sb(Ⅲ)氧化和抗性、壓力響應(yīng)、碳代謝、細胞運動性、磷酸鹽和磷酸酯代謝、核苷酸和氨基酸代謝等相關(guān)蛋白/基因的表達;且在加Sb(Ⅲ)條件下,菌株GW4-ΔaioA中這些代謝路徑蛋白/基因上調(diào)更顯著。因此我們認為這是由于細胞周質(zhì)Sb(Ⅲ)氧化消失后,Sb(Ⅲ)對細胞造成了更多的毒害作用,因此細胞質(zhì)中AnoA和氧化壓力相關(guān)的蛋白均上調(diào),加快細胞內(nèi)Sb(Ⅲ)的氧化;同時,TCA循環(huán)上調(diào)從而產(chǎn)生更多的
10、能量供菌株生長并抵御Sb(Ⅲ)的毒性;Sb(Ⅲ)氧化過程中產(chǎn)生的能量用于Sb轉(zhuǎn)運、DNA損傷修復、蛋白質(zhì)的合成、細胞運動等。
綜上,本論文通過對異養(yǎng)型Sb(Ⅲ)氧化菌GW4的系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)了新型銻氧化酶,首次提出了細菌的Sb(Ⅲ)氧化是一個由酶促反應(yīng)(AnoA,AioAB)和非酶促反應(yīng)(H2O2)共同組成的共代謝過程。此外,還闡明了砷氧化酶AioAB對Sb(Ⅲ)壓力響應(yīng)代謝路徑和能量產(chǎn)生的影響,解析了菌株GW4在加Sb(Ⅲ)條
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