碳點對稀有鮈鯽胚胎發(fā)育及生殖毒性效應.pdf

1、碳點（Carbon quantum dots，CDs）是一種新型納米材料，在環(huán)境監(jiān)測、生物探針與成像、藥物運輸?shù)确矫嬗兄鴱V泛的潛在用途。然而，對其生物毒性的報道很少，對毒性機制的研究也十分缺乏。根據(jù)2014年市場調(diào)查報道，估計當年的碳納米材料的市場價值已達到20億美元。然而，隨著CDs用量的增加，環(huán)境排放量也將增加，不可避免地進入水體，那么它是否會對水生生物有什么危害，還有許多未知。因此，本研究以稀有鮈鯽（Gobiocypris rar

2、us）為實驗對象，分別就CDs對稀有鮈鯽胚胎早期發(fā)育毒性及成魚的生殖毒性效應進行探討。
　　本研究分成兩大部分：第一部分實驗是探究CDs對稀有鮈鯽胚胎發(fā)育的毒性效應，實驗濃度設置：0（空白對照組）、1、5、10、20、40、80mg/L濃度組，采用水體浸泡暴露方式，在胚胎發(fā)育至12、24、48、72、96hpf（Hours post fertilization）時，檢測不同濃度CDs對稀有鮈鯽胚胎形態(tài)/行為指標、生化指標（抗氧化酶

3、、ATP酶）、發(fā)育相關(guān)基因（血管內(nèi)皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Vezf1）、Wnt8a、肌細胞生長抑制素（Mstn）、維甲酸受體α（RARα））mRNA表達、DNA損傷等方面的影響，對CDs誘導胚胎產(chǎn)生畸形/死亡的原因進行探討。第二部分是探究CDs對稀有鮈鯽成魚的生殖毒性效應，實驗濃度設置為對照組（0.65％NaCl對照組）、20、40、80、160、320mg/L濃度組，采取腹腔注射的暴露方式，檢測不同濃度的CDs對稀有鮈鯽精子運動活力、精子DN

4、A損傷、受精率、子代的生長發(fā)育情況以及一周后卵巢/精巢組織結(jié)構(gòu)的影響，對不同濃度CDs誘導成魚的生殖毒性進行探討。通過這兩部分的實驗，初步探討CDs對魚類的早期發(fā)育毒性及生殖毒性效應，旨在為CDs對生物的安全性評估提供基礎資料；通過生化指標（抗氧化酶、ATP酶）、發(fā)育相關(guān)基因（Vezf1、Wnt8a、Mstn、RARα）定量分析、DNA損傷等方面的檢測，對CDs誘導胚胎產(chǎn)生畸形/死亡的原因進行初步探討。
　　CDs對稀有鮈鯽胚胎發(fā)

5、育的毒性效應實驗顯示：CDs濃度組胚胎出現(xiàn)胚胎自主運動頻率減緩、心率加快、靜脈竇到動脈球之間的距離（SV-BA）變長、體長縮短、心包囊/卵黃囊水腫、脊柱/尾部彎曲等多種毒性效應，改變胚胎孵化時間，并導致孵化率降低。畸形率隨CDs濃度的升高而升高。Na+/K+-ATP酶活性隨CDs濃度的增大有降低趨勢，可能使Na+被泵出細胞的頻率受到影響，使Na+在細胞內(nèi)大量積聚，引起細胞水腫。此外，Vezf1隨CDs濃度增大而下調(diào)，影響了心血管功能，造

6、成胚胎心率加快。各CDs組胚胎的Ca2+-ATP酶活性呈濃度依賴性降低， Ca2+-ATP酶活性受到抑制，Ca2+在胚胎內(nèi)累積，促進骨骼異常發(fā)育。Mstn以及Wnt8a隨CDs濃度增大表現(xiàn)出上調(diào)趨勢。Mstn負向調(diào)節(jié)肌細胞的生長，其上調(diào)說明肌細胞的生長發(fā)育受到抑制。Wnt8a是體軸延伸的關(guān)鍵因子，Wnt8a上調(diào)說明仔魚體軸延伸受到抑制。Ca2+-ATP酶活性降低會促進骨骼發(fā)育，而Mstn和Wnt8a上調(diào)抑制肌細胞生長和體軸延伸，因此稀有

7、鮈鯽胚胎出現(xiàn)脊柱、尾部出現(xiàn)彎曲。Mstn72hpf上調(diào)顯著，這與72hpf后畸形率顯著升高，仔魚體全長低于對照組相一致。
　　超氧化物歧化酶（SOD）活力呈現(xiàn)出被誘導狀態(tài)，過氧化氫酶（CAT）和SOD變化有一定的同步性。CAT和SOD變化同步可能是由于SOD歧化活性氧（ROS）會產(chǎn)生大量的過氧化氫（H2O2），從而誘導CAT產(chǎn)生。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活力在12、24hpf均較低，可能是因為SOD和CAT活力上升，清除自由基

8、，氧化應激能力有所恢復，未誘導GPX產(chǎn)生。隨暴露時間延長，GPX被顯著激活，協(xié)同CAT對抗氧化應激，清除SOD歧化ROS的產(chǎn)物——H2O2。通過GPX、SOD、CAT酶活性的變化，看出抗氧化酶聯(lián)合清除體內(nèi)多余的自由基，使低濃度組的稀有鮈鯽胚胎機體內(nèi)丙二醛（MDA）維持在一定含量，但20~80mg/L濃度組長時間暴露，超出機體抗氧化防御能力范圍，誘導MDA維持在較高水平?？寡趸富钚员徽T導與MDA含量的升高說明CDs暴露對稀有鮈鯽胚胎/仔

9、魚產(chǎn)生了氧化脅迫，這可能是造成其胚胎發(fā)育異常的一個原因。隨CDs濃度的增大及處理時間的延長，稀有鮈鯽胚胎/仔魚DNA損傷程度逐漸增加，畸形率與死亡率也升高。這說明CDs暴露對稀有鮈鯽胚胎造成了DNA損傷，從而導致胚胎出現(xiàn)畸形或死亡。
　　CDs對稀有鮈鯽成魚的生殖毒性效應實驗顯示：CDs處理會對稀有鮈鯽精巢結(jié)構(gòu)的具有一定損傷，主要影響表現(xiàn)在精小葉及精小囊基膜溶解、斷裂，基膜中的部分細胞周圍形成空泡。此外，還表現(xiàn)在隨CDs處理濃度的

10、增大，雄魚的GSI減?。痪佑行н\動時間及激活率都有降低的趨勢；雄魚精子DNA受到一定程度的損傷。在對子代受精卵的受精率和畸形率統(tǒng)計中，發(fā)現(xiàn)CDs處理組受精率低于對照組，而畸形率高于對照組，可能是CDs對雄魚精巢結(jié)構(gòu)的損傷以及精子DNA損傷導致精子活力和受精力降低，最后造成受精率下降及后代畸形率升高。此外， CDs處理使稀有鮈鯽20、80、320mg/L濃度組雌魚產(chǎn)卵次數(shù)減少，對稀有鮈鯽的繁殖行為產(chǎn)生了抑制。此外，高濃度組（160、32

11、0mg/L）卵巢出現(xiàn)一定程度卵細胞退化，可能是CDs處理組雌魚產(chǎn)卵次數(shù)減少的一個原因。
　　本研究結(jié)果表明：（1）一定濃度CDs對稀有鮈鯽胚胎/仔魚有明顯的發(fā)育毒性，引起胚胎自主運動頻率減緩、心率加快、靜脈竇到動脈球之間的距離（SV-BA）變長、體長縮短、心包囊/卵黃囊水腫、脊柱/尾部彎曲等多種毒性效應，改變胚胎孵化時間，并導致孵化率降低；Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及發(fā)育相關(guān)基因的變化會造成胚胎畸形；氧化應激、