植物病毒病的檢驗與鑒定

1、,,植物病毒病的診斷與鑒定,晶,,,,植物病毒病的診斷與鑒定,,植物病毒?。菏怯芍参锊《炯纳鸬牟『?,,植物病毒病的危害及作用,1.病毒引起的病害在數(shù)量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫蘆科等。在遼寧省引起毀滅性的植物病毒病有番茄蕨葉病毒病，辣椒花葉病毒病和煙草脈壞死病毒病等。2.生產(chǎn)上危害較大的植物病毒病害有：煙草花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯病毒病、玉米矮花葉病等。3。植物

2、病毒也有可利用的價值，特別在開發(fā)基因工程的載體、轉(zhuǎn)基因植物研究等方面，發(fā)揮了很大的作用。,,植物病毒病的診斷與鑒定,植物病毒簡介,植物病毒病的癥狀特點,植物病毒病的鑒定方法,植物病毒病的防治,,一、植物病毒病簡介,觀察需要電子顯微鏡植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼，有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類。核酸5--40%，蛋白質(zhì)60-95%。植物病毒類型多樣，結(jié)構(gòu)特異,,植物病毒主要類型1.長

3、而彎曲的線狀粒體 2.僵直的桿狀粒體 3.示桿狀或線狀病毒核酸與蛋白亞基的排列 4.桿菌狀粒體 5. 桿菌狀粒體橫切面 6.多角體病毒粒體 7.二十面體的核酸與蛋白亞基的排列,,二、植物病毒病的癥狀特點,一、外部癥狀(Symptom)： 病毒病害在癥狀表現(xiàn)上多為系統(tǒng)發(fā)病，表現(xiàn)為變色、畸形，少數(shù)引起壞死、腐爛，萎蔫極少發(fā)生。 變色：花葉，黃化。 壞死：也稱作枯斑反應，如馬鈴薯Ｙ病毒的某些株系侵染煙草可產(chǎn)生脈壞死。 畸形：抑制型

4、：矮化，卷葉，皺葉，蕨葉。 刺激型：叢生，腫瘤。,,花葉（變色界限明顯）,山茶花葉病,,黃化（葉柄發(fā)黃）,,壞死：以植物的組織和細胞死亡為特征，表現(xiàn)為枯斑、腐爛、焦枯等。,,,,,葉片卷曲,大麗花病毒病,,皺葉病,蘋果皺葉病,,,蕨葉病毒??；即葉片先從心部開始變硬呈帶狀或絲狀扭曲，嚴重者僅有一粗條葉脈，不能正常開花。,,馬鈴薯瘤腫病,腫瘤：主要為病害植株地下部分，薯塊和匍匐莖上發(fā)生普遍。被害塊莖的芽眼和

5、匍匐莖，由于病菌刺激細胞不斷分裂，形成大小不一、形狀不定、粗糙突起的腫瘤,,,二、 病組織的內(nèi)部和細胞的變化： 1. 組織變化： 組織壞死：如煙草花葉病毒TMV，它侵染心葉煙引起薄壁組織壞死，有些引起莖部維管束和葉部壞死，煙草花葉病毒侵染大豆引起頂芽和側(cè)枝壞死。一般引起黃化類型的病毒病多是因輸導組織、韌皮部壞死引起。,,組織壞死,,組織增生：病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生激素，引起增生。病組織的薄壁細胞分裂加快，數(shù)

6、量迅速增多，使局部組織出現(xiàn)腫瘤或癌腫.有時植物細小的不定芽或不定根大量萌發(fā)生成叢枝或發(fā)根，也是增生的結(jié)果。,,,組織增生,,2. 細胞的變化： 花葉和斑駁是由于細胞內(nèi)葉綠素遭到破壞所致。 內(nèi)含體：某些植物被病毒侵染后，在病組織中產(chǎn)生的一種特殊結(jié)構(gòu)，存在于細胞質(zhì)或細胞核中，在顯微鏡下可以觀察到。 內(nèi)含體的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作為一種診斷的指標。 ②但并不是所有的病毒病都有內(nèi)含體，有些必須發(fā)育到一定階段才形成，同時一

7、種病毒還可有多種形態(tài)的內(nèi)含體，因此，單靠內(nèi)含體診斷還有一定的局限性。,,內(nèi)含體,,甜椒表皮組織顯微鏡照片，經(jīng)紫紅核酸染劑染色，可看到中空的晶體狀內(nèi)含體,可在細胞內(nèi)看到晶體內(nèi)含體(箭頭)。N:細胞核，S:氣孔。,,,三、患病植物的生理變化：表現(xiàn)為：①病毒侵染后呼吸強度先上升，后下降。 ②碳水化合物含量下降。 ③淀粉在葉部積累引起黃化。 ④多酚氧化酶和細胞色素氧化酶的活性增強，使細胞中毒壞死。⑤光合作用下降，破壞了寄主

8、的葉綠素。 ⑥植物內(nèi)源激素水平失去平衡，造成畸形,植物病毒病的癥狀特點,,三、植物病毒病的鑒定方法,（一）傳統(tǒng)生物學鑒 定方法,目測法:利用病毒在植株上表現(xiàn)出來的外部特征進行鑒定根據(jù)病毒的傳播方式可以確定病毒的屬。病毒的媒介傳播是確定病毒的輔助方法。指示植物鑒別法：利用將病毒接種在指示植物上表現(xiàn)出的特征性狀，作為鑒定是否感染病毒,,（二）物理特征鑒別法1.稀釋限點(Dilution End Point，DEP) 保持病毒侵

9、染力的最高稀釋度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。2.鈍化溫度(Thermal Inactivation Point,TIP) 處理十分鐘使病毒喪失活性的最低溫用攝氏溫度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有45℃；最高的是煙草花葉病毒，為97℃；而大多數(shù)植物病毒在55—70℃之間；3.體外存活期(Longevity in vitro，LIV) 在室溫(20

10、~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最長時間。大多數(shù)病毒的存活期在數(shù)天到數(shù)月。,,4 ．沉降系數(shù)及分子量 沉降系數(shù)的測定要用超速分析離心機，根據(jù)該病毒在一定離心力下沉降的速度來計算。有了沉降系數(shù)還可以來計算分子量。5．光譜吸收特性 由于蛋白質(zhì)和核酸都能吸收紫外線，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此260／280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于區(qū)分不同的病毒，比值小的多是線條病毒，比值高可能是球狀病毒

11、。,,（三）免疫化學鑒定法1.電鏡觀察方法2.細胞病理學法：植物侵染病毒后會引起一系列的植物細胞病理變化，如在細胞內(nèi)形成病毒內(nèi)含體，影響細胞的結(jié)構(gòu)等。利用顯微鏡技術(shù)對病毒侵染引起的細胞病理學變化進行觀察來檢測病毒的存在與種類。3.血清學鑒定　血清學反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。最常用的有凝集反應、沉淀反應（瓊脂雙擴散法）、補體結(jié)合反應，酶聯(lián)免疫吸附試驗,,瓊脂雙擴散為可溶性抗

12、原與抗體在瓊脂凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應。當對應的抗原、抗體在半固體瓊脂中相遇，且二者比例適當時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線，這組沉淀線是一組抗原、抗體的特異性復合物。當瓊脂中有多組不同的抗原、抗體存在時，便各自依其擴散速度的差異，在適當?shù)牟课恍纬瑟毩⒌某恋砭€。,,免疫瓊脂雙向擴散是將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應的小孔中，兩者各自向四周擴散，如抗原與抗體相對應，兩者相遇即發(fā)生待異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線 ( 圖 5-1)

13、 。如果所加抗原和抗體標本中分別含有若干與血清學反應無關(guān)的抗原抗體，則因各種抗原的擴散系數(shù)和各對抗原抗體間的最適比例不同，以及抗原抗體復合物所形成的沉淀線具有選擇性滲透屏障作用，擴散后可以形成若干條沉淀線， — 條沉淀線代表一對抗原抗體。因此，通過雙向免疫擴散試驗，用已知抗體 ( 或抗原 ) 檢測未知抗原 ( 或抗體 ) ，可鑒定抗原性物質(zhì)或免疫血清的濃度、純度及比較抗原之間的異同點。左圖為模式圖，右圖為實際試驗的結(jié)果。上，兩個抗原孔

14、里含有相同的抗原，沉淀線是不分叉的;中，兩個抗原孔里的抗原完全不同，沉淀線分叉;下，兩個抗原孔里的抗原部分相同，沉淀線部分交叉。,,補體結(jié)合反應是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應。補體無特異性，能與任何一組抗原抗體復合物結(jié)合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的復合物結(jié)合，就溶血現(xiàn)象，如果與細菌及相應抗體復合物結(jié)合，就會出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個試驗需要有補體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指

15、示系統(tǒng)（綿羊細胞和溶血素）五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對應的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對應。,,,酶聯(lián)免疫吸附試驗（簡稱ELISA）將酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結(jié)合,既保持了酶催化反應的敏感性,又保持了抗原抗體反應的特異性,因而極大的提高了靈敏度,,（三）分子鑒定法 主要有核酸雜交和聚合酶鏈式反

16、應(PCR)核酸分子雜交技術(shù) 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫度及離子強度等)可按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測的核酸。從而測出要檢測病毒的DNA序列。,,多聚酶鏈式反應(PCR)技術(shù) 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。由于它具有強大的擴增能力,并且可與其它分子生物學方法(如核酸雜交)和免疫學方法(如ELISA)相結(jié)合應用,使其敏感性和特異性都大

17、大增強,2/21/2024,《園林植物保護》精品課程建設,選用無毒材料,采用莖尖脫毒組織培養(yǎng)法繁殖的無毒苗，但栽植后必須及時防除傳毒昆蟲。,,選用抗病品種,選用耐病和抗病優(yōu)良品種是防治病毒病的根本途徑。,,嚴格挑選無毒繁殖材料，如塊根、塊莖、種子、幼苗、插條、接穗、砧木等，以減少傳染來源。,莖尖脫毒,,四、植物病毒病的防治,,,,參考文獻1.施曼玲、周雪平，植物病毒病的診斷技術(shù)，微生物學報，2000，272.洪 健, 李德葆, 周雪

18、平. 植物病毒分類圖譜. 北京:科學出版社, 20013.王健華. 海南省 CMV 黃燈籠辣椒分離物的亞組鑒定.[碩士學位論文]. 海南儋州: 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學, 20044.張仲凱, 李 毅. 云南植物病毒. 北京: 科學出版社,20015.除東平, 謝聯(lián)輝. 黃瓜花葉病毒亞組研究進展. 福建農(nóng)業(yè)大學學報, 1998, 27(1): 82! 916.袁小環(huán), 李 青. 血清學方法和分子生物學方法檢測植物病毒研究進展.