國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

1、1,《中國藥典》無菌及微生物限度檢查法發(fā)展與修訂,重慶市食品藥品檢驗所 2014.3.20,2,醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn),醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)明與發(fā)展進步極大地改變了人類的命運獨具特色的中藥注射液特殊的醫(yī)藥環(huán)境使我國成為規(guī)模龐大的“吊瓶大國”注射用藥品成為“高風(fēng)險產(chǎn)品”,3,醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn),微生物控制及檢驗成為高難度工作 一百多年來人們努力提高在“有菌的環(huán)境”生產(chǎn)“無菌的產(chǎn)品”的能力，事實證明這一努力至今充滿挑戰(zhàn)。 ★

2、2006年7～8月發(fā)生了震驚 全國的“欣弗事件” ●直接死亡11人 ●企業(yè)倒閉 ●至今余震不斷,4,醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn),“欣弗事件”對我國的藥品生產(chǎn)監(jiān)管產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，直接推動了新的藥典方案和新版GMP規(guī)定的出臺。 ☆ “欣弗事件”將永遠(yuǎn)成為無菌藥品生產(chǎn)典型反面教材有人借此詆毀中國醫(yī)藥產(chǎn)品是在廁所生產(chǎn)的，理由是從未開封的欣弗中分離出了污水常見菌——肺炎克雷伯菌,顯微圖像,單菌落,5,醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)

3、,2012年10月，美國新英格蘭合成制藥中心生產(chǎn)的注射用類固醇霉菌污染，造成數(shù)百人感染真菌腦炎，至年底統(tǒng)計死亡39人。 在50支密封藥瓶中檢測出曲霉菌和突臍乳孢菌兩種類型,6,藥品微生物污染的反思,在醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展過程中，盡管世界各國付出過慘重代價，實際上稍有不慎悲劇仍然可能重演。 悲劇的避免!尊重規(guī)律，科學(xué)監(jiān)管，全程無縫監(jiān)控，嚴(yán)格落實各項管理、驗證、檢查和分析調(diào)查措施，切實降低無菌藥品的微生物污

4、染風(fēng)險。,7,歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展,74年、84年、90年衛(wèi)生部《藥品衛(wèi)生學(xué)檢查法》；86年衛(wèi)生部頒布《藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》1995年版藥典首次收載微生物限度檢查法2000年版藥典首次收載微生物限度標(biāo)準(zhǔn)2005版 ＊將按劑型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度 ＊首次收載方法驗證要求 ＊無菌檢查培養(yǎng)時間與國外接軌2010版 ＊首次收載培養(yǎng)基適用性檢查要求 ＊強調(diào)對微生物檢驗過程的驗證

5、及過程控制 ＊部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論,8,中國藥典2010年版的框架組成,無菌檢查法微生物限度檢查法滅菌法 抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則藥品微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則,9,修訂背景,歐、美、日等主要藥典均收載了協(xié)調(diào)一致的微生物檢查法和限度標(biāo)準(zhǔn)，由于歷史原因，我國目前的微生物限度檢查體系與國際相比存在差距，這一差距對于目前我國企業(yè)

6、產(chǎn)品出口造成很大的障礙，也對我國的微生物質(zhì)量控制造成很大困惑。,10,修訂背景,雖然中國目前不是ICH的成員國，而是以觀察員的身份進入，但中國與國外制藥行業(yè)交往日益增多，中國藥品要想進入國際市場，藥品的檢驗方法和標(biāo)準(zhǔn)與ICH保持一致，勢在必行。,11,2015版藥典修訂的具體原則,檢驗方法與國外藥典進一步協(xié)調(diào)；已有的指導(dǎo)原則實用化，通過科研解決指導(dǎo)原則實用化問題；增加新的指導(dǎo)原則，特別是對與企業(yè)過程控制相關(guān)的指導(dǎo)原則。,12,201

7、5版藥典無菌及微生物限度檢查法目標(biāo),建立統(tǒng)一的質(zhì)量技術(shù)要求，保持各方藥典科技水平一致，保證用藥安全、有效。質(zhì)量控制、檢驗技術(shù)、檢驗標(biāo)準(zhǔn)等減少國際貿(mào)易的障礙。統(tǒng)一醫(yī)藥產(chǎn)品進入國際市場的技術(shù)門檻，促進國際間藥品在同一技術(shù)平臺的公平競爭。,13,2015版藥典無菌及微生物限度檢查法,,,化學(xué)藥品與生物制品：★與協(xié)調(diào)案統(tǒng)一★與國際先進水平同步發(fā)展,,,,具體目標(biāo),中藥： ★加大科研投入，在方法上與協(xié)調(diào)案統(tǒng)一，在項目、限度等方面制定

8、與中藥相適應(yīng)的目標(biāo)。 ★以我為主，引領(lǐng)國際發(fā)展。,14,2015版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內(nèi)容,修訂后的中國藥典微生物檢驗系統(tǒng)成為一個較完備的標(biāo)準(zhǔn)體系，將收載15個左右的微生物檢查法和指導(dǎo)原則。 修訂后的中國藥典微生物檢測系統(tǒng)與國外完全一致。對實驗環(huán)境進行了重大修訂。,15,無菌檢查實驗室環(huán)境規(guī)定的修訂,修訂依據(jù)及意義： 2010年版GMP中附錄一《無菌藥品》和附錄三《生物制品》中均規(guī)定，非最終滅菌產(chǎn)品

9、各工序關(guān)鍵操作環(huán)境應(yīng)為B級背景下的A級；無菌檢查的潔凈環(huán)境不得低于生產(chǎn)關(guān)鍵區(qū)的潔凈環(huán)境要求。,16,無菌檢查法的培養(yǎng)基系統(tǒng),培養(yǎng)體系的差異是導(dǎo)致中國藥典無菌檢查與國外藥典無菌檢查的系統(tǒng)性差異，從而帶來結(jié)果之間的不確定性及不可比性。這是我國藥典無菌檢查法必須關(guān)注的問題！,17,無菌檢查培養(yǎng)基及其有關(guān)內(nèi)容的修訂,無菌檢查是一個定性試驗，根據(jù)檢查方法，要求所用培養(yǎng)基具有廣譜的促菌生長能力，而不是也不可能一開始就對可能污染的微生物分類進行培養(yǎng)

10、。為此，各國藥典無菌檢查用培養(yǎng)基都有一個不斷改進至基本確定的發(fā)展過程。1950年美國藥典第十六章已確定使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)現(xiàn)USP、BP、EP、JP及ICH均規(guī)定使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)但在我國長期的微生物分類培養(yǎng)觀念下，認(rèn)為改良馬丁培養(yǎng)基(MM)更適用于真菌檢查。,18,,2011年藥典會微生物專業(yè)委員會立題對無菌檢查用培養(yǎng)基進行了研究——

11、《國產(chǎn)胰酪大豆胨培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的微生物促生長能力考察》對國產(chǎn)的3個廠家的MM培養(yǎng)基和3 個廠家的TSB培養(yǎng)基與BD公司的TSB培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)對比實驗。,19,實 驗 菌 株,細(xì)菌：藤黃微球菌[CMCC(B)28001]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]克氏庫克菌（北京所參加國際微生物鑒定所得）真菌：黑曲霉[CMCC(F)98003]臘葉芽枝霉[CMCC(F)7702]一株從樣品或環(huán)境中分離的霉菌,2

12、0,7個實驗室的實驗結(jié)論,經(jīng)統(tǒng)計分析表明：國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)和改良馬丁培養(yǎng)基(MM)的促菌生長能力無顯著性差異。國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)和改良馬丁培養(yǎng)基(MM)適宜生長的微生物種群（廣譜性）無顯著性差異。國產(chǎn)的兩種培養(yǎng)基不比BD公司生產(chǎn)的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)質(zhì)量差。,21,2015版無菌檢驗用培養(yǎng)基的修訂,22,2015版無菌檢查法修訂,增訂了無菌檢查法所用培養(yǎng)基的性能定義“硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

13、（FTG）是厭氧菌檢查的首選培養(yǎng)基，同時也可用于需氣菌檢查?！薄耙壤掖蠖闺艘后w培養(yǎng)基（TSB）適用于真菌和需氣菌的檢查?！薄茨撤N污染了需氣菌的供試品，無論被接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTG）中還是被 接種在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中均可被檢出。意義：糾正了微生物學(xué)檢查中長期存在的對微生物分類培養(yǎng)的概念，提高污染微生物的檢出率，與先進國家藥典保持一致。,23,根據(jù)培養(yǎng)基的調(diào)整所做的相關(guān)調(diào)整,,,,,,,,,,,,,,,,

14、,,由TSB替代MM,兩種培養(yǎng)基接入試驗菌的調(diào)整,各菌接種的培養(yǎng)基調(diào)整,培養(yǎng)基修訂,培養(yǎng)基靈敏度檢查及方法適用性試驗中的修訂,菌液制備用培養(yǎng)基的修訂,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（大腸埃希菌）、生孢梭菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉,24,三部藥典無菌檢查方法的整合修訂,整合中的焦點：三部無菌檢查法中規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須分成雙份，分別置30~35℃、20~25 ℃兩個

15、溫度下培養(yǎng)。以致在取樣量、檢驗量、接種方式、培養(yǎng)溫度、陽性對照試驗等方面存在與二部不一致的規(guī)定。,25,國際上生物制品無菌檢查法的情況,美國FDA（May2001）和歐盟（March1999）均早已接受藥典無菌檢查法適用于生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品（見ICH Q6B生物技術(shù)產(chǎn)品/生物制品檢定規(guī)程及標(biāo)準(zhǔn)）。USP、EP、BP、JP及ICH的無菌檢查法中均沒有對生物制品作出特殊的規(guī)定。,26,,分歧出現(xiàn)在我國對WHO 6號規(guī)程的引用上。從可以

16、查到的《中國生物制品規(guī)程》1979年版開始，規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基雙份置雙溫度下分別培養(yǎng)。 這一規(guī)定一直被延續(xù)到2010年版三部的無菌檢查法，成為長達35年的我國生物制品無菌檢查法的特殊規(guī)定。,27,整合調(diào)查,據(jù)反映，歷史上個別地區(qū)在生物制品無菌檢查中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)個別品種在20~25℃ 培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中有菌生長的情況（但未作鑒定和溯源明確是什么菌）。從微生物適宜培養(yǎng)條件分析嗜熱型需氧菌適宜生長溫度為45~58℃；

17、嗜溫型需氧菌適宜生長溫度為20~44℃；嗜冷型需氧菌適宜生長溫度為10~18℃；疑點和疑問：陽性產(chǎn)品實驗操作中是否有確保無污染的證明？是否存在未知的厭氧菌必須在20~25℃ 培養(yǎng)才能生長？在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基20~25℃ 下培養(yǎng)能不能被檢出？,28,,修訂原則 以國際發(fā)展趨勢為主導(dǎo)，遵照2015年版藥典編制大綱三部藥典必須整合的要求進行，以二部為基礎(chǔ)，在檢驗數(shù)量、檢驗量、陽性對照樣品量、陽性對照試驗方法、培養(yǎng)溫度等方面互

18、相兼顧，作原則性要求而不作具體細(xì)則規(guī)定。致力于今后逐步統(tǒng)一完善。,29,無菌檢查法其他主要的修訂,30,,31,2015年版中國藥典微生物限度檢查法修訂,,非無菌藥品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法,非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查法,非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),參照USP35版和EP7.0版對微生物限度檢查法收載形式進行了修訂，將其分為三個附錄：,32,微生物限度檢查法實驗環(huán)境的變化,總的原則： 無外源性微生

19、物污染樣品 樣品的微生物檢測環(huán)境不低于樣品的生產(chǎn)環(huán)境,33,微生物限度檢查法技術(shù)方法適用范圍變化,嗜溫型微生物最適生長溫度為20℃ ~44℃（ 25℃~43℃）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37℃白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為28℃,34,微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂,試劑和試藥中和劑、滅活劑和表面活性劑均應(yīng)對微生物無毒性，其相互間具有相容性，有利于樣品中微生物均

20、勻分布。 稀釋液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液； pH7.2 無菌磷酸鹽緩沖液； pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）；pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸溶制劑）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基★不限于上述稀釋液（如0.9%無菌氯化鈉溶液）,35,微生物限度檢查計數(shù)法,,,修訂前大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉,,,,試驗菌株,修訂后銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲

21、霉,36,微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)基和試驗菌的修訂,37,微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)溫度和時間的修訂,38,微生物限度檢查計數(shù)法接種方法的修訂,39,微生物限度檢查計數(shù)法方法的修訂,40,適用性試驗加入方式舉例：,各試驗組溶液分裝5份每份9.9ml,,,,,,,,+0.1ml金黃色葡萄球菌液,+0.1ml銅綠假單胞菌液,+0.1ml枯草芽孢桿菌液,+0.1ml白色念珠菌液,+0.1ml黑曲霉菌液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

22、,,,,,,41,微生物限度檢查計數(shù)法檢測項目及結(jié)果判斷的修訂,42,微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷有計數(shù)干擾情況時的修訂,43,微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷的修訂,44,微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷增訂內(nèi)容,45,微生物限度檢查控制菌檢查的修訂,46,微生物限度檢查控制菌檢查的修訂,47,微生物限度檢查控制菌檢查的修訂,48,2015版微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的修訂,,,◆將2010版中國藥典一、二、三部微生物限度標(biāo)準(zhǔn)項目進行對比、整合?！舨捎?/p>

23、一部的限度標(biāo)準(zhǔn)項目作為合并后限度標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。,,,,修訂思路,◆與美、歐、日藥典比較，修訂中國藥典的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。◆采用清晰直觀的表格形式，按給藥途徑，分液體、固體性質(zhì)，列出各類藥品的限度標(biāo)準(zhǔn)。,49,修訂后限度標(biāo)準(zhǔn)的總體結(jié)構(gòu)及規(guī)定（共9項，4個表）,,,,,,,,,,,1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標(biāo)示無菌的制劑和原輔料應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。,2、用于手術(shù)、燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無菌檢查規(guī)定,3、非無菌化學(xué)藥品

24、及生物制品制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（見表1）,4、非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（見表1）,5、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（見表2）,6、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（見表3）,7、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（見表4）,8、有兼用途徑的制劑應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn),9、霉變、長螨者以不合格論,限度標(biāo)準(zhǔn),50,,表1、非無菌化學(xué)藥品及生物制品制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)及非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生

25、物限度標(biāo)準(zhǔn)表2、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)表3、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)表4、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn),51,微生物檢測體系及藥品微生物檢驗的關(guān)鍵點,環(huán)境保證,培養(yǎng)基保證,藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則,潔凈實驗室微生物控制和監(jiān)測指導(dǎo)原則,無菌檢查隔離系統(tǒng)指導(dǎo)原則,SOP操作,有效的方法,方法適用性（驗證）,有效的結(jié)果,可靠的結(jié)論,結(jié)果判斷,無菌性檢查,靈敏度檢查,對照培養(yǎng)基,藥

26、品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則,微生物檢查法指導(dǎo)原則,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,52,2015版藥典修訂的基本目標(biāo),2015年版中國藥典微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)體系將推動藥品微生物實驗室從一個簡單的終產(chǎn)品檢驗實驗室向微生物風(fēng)險調(diào)查分析型實驗室方向發(fā)展。 案例介紹,53,,氟康唑注射液生物負(fù)荷偏差調(diào)查及處理2011年7月，在進行趨勢分析時，發(fā)現(xiàn)有5批 氟康唑注射液灌裝后生物負(fù)荷監(jiān)測有超限趨勢，經(jīng)過初步評估后，負(fù)責(zé)污染問題

27、的委員會決定啟動偏差調(diào)查，查明導(dǎo)致產(chǎn)生污染的根本原因、確定和實施相關(guān)預(yù)防措施，并監(jiān)測其有效性。,54,,（1）確定調(diào)查范圍：根據(jù)產(chǎn)品發(fā)生情況和調(diào)查時間，調(diào)查相關(guān)批號206個。（2）鑒定：根據(jù)細(xì)菌鑒定，氟康唑注射液瓶中的微生物有兩種：一種為水里存在的微生物，一種為環(huán)境存在的微生物。（3）調(diào)查發(fā)生原因：一是注射用水連接管路在技術(shù)夾層中有一個低點，有存水；二是洗瓶間的一個空氣過濾器檢漏有問題。制定改正措施,55,,改正措施1-管路坡度

28、修正：管路用5%NaOH進行鈍化、滅菌；灌裝前增加一個過濾器；增加灌裝前后取樣檢測頻次；注射用水循環(huán)管路每周滅菌一次。改正措施2-更換過濾器：用0.15μm的過濾器取代0.2μm的過濾器。改正措施3-注射劑產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的各個階段進行微生物檢測，以核實產(chǎn)品在生產(chǎn)全過程中是否受微生物污染。最終滅菌產(chǎn)品在終端滅菌前進行。 ★改進措施的效果跟蹤：通過檢查，水及氟康唑注射液中均不再發(fā)現(xiàn)有上述兩種微生物。,56,,質(zhì)量審查小組的最后

29、決定 連續(xù)3批合格后（趨于平穩(wěn)），停止增加微生物灌裝前的微生物監(jiān)測，保留灌裝后的檢測；保留每周對系統(tǒng)進行一次滅菌。對有問題產(chǎn)品的質(zhì)量評估：206批中有5批不被放行，其余放行。,57,新的微生物檢驗理念,,,,,藥品因素,方法驗證,環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗,過程控制,結(jié)果判斷OOS/OOT調(diào)查,溯源調(diào)查,微生物鑒別-初步確定污染源原始數(shù)據(jù)以及陰性陽性對照回顧培養(yǎng)基及所用的其他耗材是否滿足質(zhì)量標(biāo)

30、準(zhǔn)要求實驗室環(huán)境是否符合要求取樣環(huán)境是否滿足要求樣品本身是否具有使微生物存活或繁殖的特性同期進行檢驗的其他結(jié)果是否正常消毒劑是否在有效期內(nèi)，且消毒是否正確,,,溯源調(diào)查,,58,按照標(biāo)準(zhǔn)進行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定,API試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn),微生物鑒定,熒光免疫篩選系統(tǒng),免疫凝集/免疫沉淀實驗,微生物檢測,實時熒光定量PCR,,色譜、光譜分析技術(shù),,分子生物學(xué)技術(shù),理念變化 ——實驗者由按嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)檢驗向依據(jù)統(tǒng)一的

31、原則選擇適宜的方法檢驗轉(zhuǎn)變,,傳統(tǒng)篩選系統(tǒng),BioLumixTM實時快速微生物熒光光電檢測系統(tǒng),BD FACSMicroCountTM全自動微生物分析儀,半自動細(xì)菌鑒定儀（ATB Expression）,59,基于DNA的分子分型技術(shù),16S rDNA分型,指紋圖譜技術(shù),重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Rep-PCR),脈沖場電泳技術(shù)（PFGE）,多位點序列分析 (MLST),多位點重復(fù)序列分析 (MLVA),隨機擴增的多態(tài)性DNA(RA