五節(jié)培養(yǎng)基medium

1、第五節(jié) 培養(yǎng)基(medium),定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。特點(diǎn)：任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)。所以一旦配成必須立即滅菌。用途：促進(jìn)微生物生長；積累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品。,培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營養(yǎng)特點(diǎn)（目的明確） 營養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng)（營養(yǎng)協(xié)調(diào)） 物理化學(xué)

2、條件適宜（條件適宜） 根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來源（經(jīng)濟(jì)節(jié)約）,一、培養(yǎng)基的配制原則,（一）培養(yǎng)基組分應(yīng)適合微生物的營養(yǎng)特點(diǎn),即根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基；不同營養(yǎng)類型的微生物，其對營養(yǎng)物的需求差異很大。如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡單的無機(jī)物質(zhì)組成。異養(yǎng)微,,生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì)，但有機(jī)物的種類需適應(yīng)所培養(yǎng)菌的特點(diǎn)。 按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同：

3、 細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；LB (Luria-Bertani) 放線菌： 高氏一號培養(yǎng)基 真菌： 查氏合成培養(yǎng)基；PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麥芽汁 當(dāng)對試驗(yàn)菌營養(yǎng)需求特點(diǎn)不清楚的時候，可以采用“生長譜”法進(jìn)行測定。,●濃度過高——微生物的生長起抑制作用， 濃度過小——不能滿足微生物生長的

4、需要?！裉嫉龋–/N）直接影響微生物生長與繁殖及代謝物的形成與積累，常作為考察培養(yǎng)基組成時的一個重要指標(biāo)；,●速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例 ●各種金屬離子間的比例,碳源中的碳原子的mol數(shù)氮源中所含的氮原子的mol數(shù),C/N比值=,,例：谷氨酸生產(chǎn)中C/N ＝4/1時，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少；C/N＝3/1 時，菌體生長受抑制，而谷氨酸大量增加。,（二）營養(yǎng)物的濃度與比例應(yīng)恰當(dāng),（1）pH：各類微生物的最

5、適生長pH值各不相同： 細(xì) 菌：7.0~8.0放線菌：7.5~8.5 酵母菌：3.8~6.0霉 菌：4.0~5.8 在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會發(fā)生改變，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩種方式：內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液

6、,（三）物理化學(xué)條件適宜,滲透壓等滲溶液適宜微生物生長高滲溶液細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離低滲溶液細(xì)胞吸水膨脹，直至破裂,大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生長，而有的菌如Staphylococcus aureus則能在3mol/L NaCl的高滲溶液中生長。能在高鹽環(huán)境（2.8~6.2/L NaCl）生長的微生物常被稱為嗜鹽微生物（Halophiles）。,（2）滲透壓和aw,各種微生物對培養(yǎng)基的氧化還原電勢的要求：好氧微生物：+

7、0.3~+0.4V,(在>0.1V以上的環(huán)境中均能生長)。厭氧微生物：只能在+0.1V以下生長。兼性厭氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下發(fā)酵。培養(yǎng)基是多氧化還原偶的復(fù)雜電化學(xué)系統(tǒng)，測出的Eh值僅代表其綜合結(jié)果。對微生物影響最大的是：分子氧和分子氫的濃度。培養(yǎng)基中常用的還原劑：巰基乙酸、抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。,（3）氧化還原電勢(redox poyential),該培養(yǎng)基的應(yīng)用目的

8、，即： 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？ 是實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物？,☆ 用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；☆ 用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時，有時還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物時要考慮是否加入特殊元素或特定的代謝產(chǎn)物；,（四）根據(jù)培養(yǎng)基的應(yīng)用目的選擇

9、原料及其來源,1. 生態(tài)模擬：調(diào)查所培養(yǎng)菌的生態(tài)條件，查看“嗜好”，對“癥”下料——初級天然培養(yǎng)基。2. 查閱文獻(xiàn)：查閱、分析文獻(xiàn)，調(diào)查前人的工作資料，借鑒人家的經(jīng)驗(yàn)，以便從中得到啟發(fā)設(shè)計(jì)有自己特色的培養(yǎng)基配方。3. 精心設(shè)計(jì)：借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法等方法。,二、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的方法,☆ 當(dāng)所設(shè)計(jì)的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價格，應(yīng)選擇來源廣泛、價格低廉 的原料，提倡以粗代精，以廢代好。,4、實(shí)驗(yàn)比 較：

10、 不同培養(yǎng)基配方的選擇比較 單種成分來源和數(shù)量的比較 幾種成分濃度比例調(diào)配的比較 小型試驗(yàn)放大到大型生產(chǎn)條件的比較 pH和溫度試驗(yàn),◆ 附1：配置培養(yǎng)基時應(yīng)注意的幾個問題及解決方法：,沉

11、淀 膠體強(qiáng)度的破壞 褐色物質(zhì)的形成 pH發(fā)生變化,高壓蒸氣滅菌：一般培養(yǎng)基： 1.05 Kg/cm2, 121.3℃, 15～30 min。含糖培養(yǎng)基：0.56 Kg/cm2, 112.6 ℃, 15～30 min。干熱空氣滅菌： 160℃， 2 h。 過濾滅菌，分別滅菌， 間歇滅,附2：滅菌,附圖：過濾滅菌,菌，紫外光，化學(xué)藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）的應(yīng)用。,,三、培養(yǎng)基的類型其應(yīng)用,1. 按對

12、培養(yǎng)基成分的了解程度來分,①天然培養(yǎng)基(complex medium)：也稱作chemically undefined medium。利用化學(xué)成分還不完全清楚或不恒定的天然物質(zhì)（如肉湯、蛋白胨、麥芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基比較經(jīng)濟(jì)，除實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用外，更適宜于在生產(chǎn)上用來大規(guī)模地培養(yǎng)微生物和生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。,②合成（組合）培養(yǎng)基(synthetic medium)：也稱作chemically d

13、efined medium. 由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，該類培養(yǎng)基的組成成分精確、清楚，重復(fù)性強(qiáng)，但微生物生長較慢，且價格昂貴，故一般適于在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)有關(guān)微生物營養(yǎng)需要、代謝、分類鑒定、生物測定以及菌種選育、遺傳分析等方面的研究工作。如高氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等。 ③半組合培養(yǎng)基(semi-defined medium)：在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加些天然成份，以更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物的需要，如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。,

14、①液體培養(yǎng)基(liquid medium)：液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑，菌體與培養(yǎng)基充分接觸，操作方便，常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)以及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物生理代謝等基本理論的研究工作?？蓳?jù)培養(yǎng)后的濁度判斷微生物的生長程度。 ②固體培養(yǎng)基(solid medium)：天然固體營養(yǎng)基質(zhì)制成的培養(yǎng)基，或液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑（瓊脂1.5～2%)而呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。為微生物的生長提供營養(yǎng)表面。常用于微生物的分離、純化、計(jì)數(shù)等方面的研究?？梢朗?/p>

15、用目的不同而制成斜面、平板等形式。,2. 按制備后培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)來分,③半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium)：在液體培養(yǎng)基中加入0.2～0.7%的瓊脂構(gòu)成的培養(yǎng)基。常用來觀察細(xì)菌運(yùn)動的特征，以進(jìn)行菌種鑒定和噬菌體效價滴定等方面的實(shí)驗(yàn)工作。 ④脫水培養(yǎng)基（dehydrated culture media）：脫水商品培養(yǎng)基，預(yù)制干燥培養(yǎng)基，指含有除水以外的一切成分的商品培養(yǎng)基，使用時只要加入適量水分并加以滅菌即可，是一

16、類既有成分精確又有使用方便等優(yōu)點(diǎn)的現(xiàn)代化培養(yǎng)基。,1. 不被微生物分解、利用、液化；2. 不因消毒滅菌而被破壞；3. 在微生物的生長溫度內(nèi)保持固態(tài)；4. 凝固點(diǎn)的溫度對微生物無害；5. 透明度好，粘著力強(qiáng)。,理想凝固劑應(yīng)具備的條件,瓊脂(agar): 石花菜中提取的高度分支的復(fù)雜多糖明膠(gelatin): 膠原蛋白制備產(chǎn)物硅膠(silica gel): 硅酸納與鹽酸聚合而成， 純無機(jī)物,凝固劑種類:,①基礎(chǔ)培養(yǎng)基(min

17、imum medium): 是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基； 另外基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分（如制備糖發(fā)酵培養(yǎng)基時）。 ②選擇性培養(yǎng)基(selective medium)：是根據(jù)某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要，或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計(jì)出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。,3. 按特殊用途劃分,③鑒別性培養(yǎng)基(differential

18、medium)：用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基，在普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)的指示劑或化學(xué)藥品，從而產(chǎn)生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物，例：伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基（Eosin Methylene Blue）。④加富培養(yǎng)基(enriched medium)：在普通培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物，如血、血清、動、植物組織液或其他營養(yǎng)物質(zhì)（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求苛刻的微生物，或用以富集（數(shù)量上

19、占優(yōu)勢）和分離某中微生物。,G+菌受抑制,G-菌,能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,不發(fā)酵乳糖不產(chǎn)酸，菌落無色透明,產(chǎn)酸力強(qiáng)，菌落呈紫綠色金屬光澤,,產(chǎn)酸力弱，菌落棕色,EnterbacterKlebsiellaHafniaSarrdia,ProteusSalmonellaShigella,E.coli,試樣,,,,,,,,,,EMB在鑒別各種腸道桿菌中的作用：,Left: Escherichia coli cells. Right: E.

20、coli colonies on EMB Agar.,EMB(Eosin Methylene Blue),細(xì)菌培養(yǎng)基——營養(yǎng)肉湯（nutrient broth)： 牛肉膏 3g； 水 1000ml； 蛋白胨 5g ； pH 7.2~7.4放線菌培養(yǎng)基——高氏1號：

21、 可溶性淀粉 20g； KNO3 1g; K2HPO4 1g MgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO4?7H2O 0.5g 水 1000ml; pH 7.2~7.4霉菌培養(yǎng)基——查氏（zapek)培養(yǎng)基： 蔗糖

22、 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O 0.5g; FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g; NaNO3 3g; pH 6.7酵母菌培養(yǎng)基——麥芽汁培養(yǎng)基,,

23、①細(xì)菌培養(yǎng)基 ②放線菌培養(yǎng)基 ③霉菌培養(yǎng)基,4. 根據(jù)所培養(yǎng)的微生物類群來分,①種子培養(yǎng)基(seed culture medium)：是為保證發(fā)酵生產(chǎn)獲得大量優(yōu)質(zhì)種子而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，特點(diǎn)是營養(yǎng)較豐富，氮源比例較高。有時為使菌種能迅速適應(yīng)后面的發(fā)酵條件，還有意識地加入發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)。②發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentation medium)：用于生產(chǎn)預(yù)定發(fā)酵產(chǎn)物，一般碳源含量往往高于種子培養(yǎng)基。大規(guī)模生產(chǎn)時，原料應(yīng)價廉易得，還應(yīng)有利

24、于下游的分離提取。,5. 根據(jù)培養(yǎng)目的來分,味精生產(chǎn)菌北京棒狀桿菌AS1299：一級種子（用搖床培養(yǎng)）培養(yǎng)基配方：,葡萄糖 3%玉米漿 2.5~3.5%尿素 0.3~0.5%K2HPO4 0.1~0.2%MgSO4 0.05%,二級種子（1200升發(fā)酵罐）培養(yǎng)基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分相同。,,The powder

25、is weighed and dissolved in a specified amount of water. pH is checked and adjusted. Then the medium is sterilized at 121º C at 15 lbs/sq. in. pressure for 15 minutes. Heat labile compounds that are to be added to t