臨床生化干擾實驗批準指

1、臨床生化干擾實驗批準指南 (EP7-A),廣東省中醫(yī)院檢驗科徐建華,目 的,為臨床生化檢驗結果中研究、鑒別和確定干擾物質效應提供背景信息、指導和實驗程序 專門為廠商和臨床實驗室制訂,作 用,對廠商來說，通過EP7程序可以篩選潛在干擾物質，量化干擾效應，證實病人樣本中的干擾，確認分析方法對干擾物質的敏感性，評估潛在的風險，并將有意義的干擾聲明提供給用戶。

2、對于臨床實驗室來說，通過EP7的調查策略，規(guī)定數(shù)據收集和分析要求，確認干擾聲明，研究明確的干擾物質帶來的結果差異，確保分析方法符合臨床要求 。,主要內容,干擾相關概念與理論適用范圍 干擾實驗的判斷標準 干擾分析前的質量保證 干擾測定用病人標本評價干擾 建立、確認和驗證干擾聲明 調查分析與臨床不一致的病人結果,術 語,分析物(Analyte)：實驗室測試的物質或者成分 干擾物（Interferent)：樣本中不同于分析物

3、并能引起測量偏倚的成分 干擾：在臨床生化中，由于另一成分影響或樣本的特性，待測一定濃度的被分析物出現(xiàn)有臨床意義的偏倚 干擾標準：干擾物所允許的最大結果偏倚干擾敏感度：某一分析方法對來自其他成分或者樣本特性的干擾引起誤差的敏感性,術 語,干擾聲明：一種物質影響分析方法結果效應的陳述干擾篩選：分析系統(tǒng)評價中，利用高濃度樣品進行一系列能鑒別有可能發(fā)生干擾的物質差異結果//異常結果//假性結果（Discrepant result//A

4、nomalous results//Spurious results)：一種與臨床不一致的結果，或同一標本的另一個不同結果，或與其他方法不同結果，或與已確定的臨床診斷不相符的結果,術 語,內源性干擾：樣本中的一些生理物質（例如膽紅素、血紅蛋白），可對另一些物質分析時引起干擾。外源性干擾：一種源自體外的物質（例如，藥物或其代謝物，防腐劑，污染物），可對樣本中另一物質的分析引起干擾。,術 語,驗證（validation）：通過調查及提供

5、客觀證據，證實可以滿足某期望用途的特定要求。(users’requirements have been met (e.g.,accuracy requirements for patients’ results)確認(verification)：通過調查及提供客觀證據,確認滿足了特定的要求。 (specified criteria have been met (e.g., interference criteria or interf

6、erence claims),適用范圍,1. 適用大部分析方法和儀器 ，特殊方法可能需要必要的調整，如分離技術和免疫學分析方法在附錄A中被討論。 2. 血清、血漿、全血、腦脊液、尿和其它大多數(shù)體液等標本類型都可用本指南評估,3. 適用以下干擾物質： 病理情況下的代謝物，如膽紅素、脂肪、蛋白質、血紅蛋白等 ；病人治療期間引入的物質，如藥物、腸外營養(yǎng)、血漿代用品、抗凝劑等；病人吸收的物質

7、，如藥品濫用、營養(yǎng)補充等；標本準備引入的物質，如抗凝劑、防腐劑等；標本處理過程中引入的污染物，如手霜、滑石粉、促凝劑等；標本自身的基質效應，其理化性質跟理想的新鮮標本不同。,適用范圍,1. 干擾對不準確度的影響 不準確度（總分析誤差）包括不精密度、方法特異性偏倚和樣本特異性偏倚（干擾），對干擾物質的敏感性可以引起系統(tǒng)誤差和隨機誤差。,基本概念,2. 分析前效應

8、 分析前分析物或者它的濃度的改變通常稱為“分析前效應”，這些作用可能會影響實驗結果的臨床應用，但不能視作“分析干擾”。這些作用：體內藥物作用 ， 如使用藥物后因生理響應使激素濃度變化標本處理， 由于蒸發(fā)、溶血或者血清長時間不分離使電解質、蛋白、水含量改變標本收集， 如在靜脈滴注時（內含分析物）取樣,基本概念,3.絕對干擾與相對干擾 干擾作用可看成是絕對的或相對的 絕對干擾：一般病人標本中含有某物

9、質，一 旦它的存在即會引起干擾。 相對干擾：一般病人標本中含有某物質，其含量相對于混合樣品中的平均濃度，不同病人樣品中含有該物質的濃度變化引起干擾作用的變化，相對干擾作用在臨床實驗中更有意義。,基本概念,基本概念,相對干擾 一些方法可以校正干擾物的平均濃度做補償，以使病人標本中的干擾效應減小到最低，有代表性的方法包括樣品前處理、設置空白對照、標準血清校準和數(shù)學校正，當干擾物的濃度大于或者小于病人樣本中的平均濃度時將

10、引起誤差。,基本概念,4. 干擾機制 由于某干擾物的存在以多種方式影響分析過程，主要機制：物理作用 干擾物具有的物理性質，使它與分析物一樣被檢測出來，如顏色、光散射（光吸收）、洗脫位置、電極響應等。 干擾物可能會改變標本的物理特性，如表面張力、黏度、濁度、離子強度等，干擾檢測結果。,基本概念,干擾機制化學作用

11、 干擾物可能會影響酶活力，例如，阻止金屬激活劑結合到活性中心上去，氧化必須的巰基等。干擾物也可破壞或阻止反應，例如，破壞試劑或抑止指示反應。干擾物也可改變分析物的形式，例如，形成復合物或沉淀。,基本概念,4. 干擾機制非特異性 干擾物可能和分析物以同樣的方式參與反應，例如，苦味酸肌酐方法中酮酸干擾，重氮膽紅素方法重吲哚酚硫酸鹽的干擾。在免疫化學方法中

12、干擾物和抗體發(fā)生交叉反應。例如，茶堿方法中咖啡因的干擾。,基本概念,4. 干擾機制水取代作用 非水物質（蛋白質、脂質），由于取代了血漿中部分水體積，影響了一些分析物的測定。這些作用考慮或不考慮為干擾作用，取決于要求的結果是以總體積的濃度表示，還是以血漿水的濃度來表示。,干擾實驗的判斷標準,為保證客觀性，可接受標準必須在評價實驗操作之前就確定。建立可接受標準時，必須考慮臨床意義和統(tǒng)計學意義兩者之間的差

13、別。,1. 臨床可接受標準基于生理變異源于臨床經驗基于被分析物變異,干擾實驗的判斷標準,2. 統(tǒng)計學意義在確定一個物質是否存在干擾前，首先確定所得到的結果是否有統(tǒng)計學意義。 3.分析物檢測濃度 干擾應該在兩種醫(yī)學決定濃度被評估，如果在一種濃度上進行測試，要注意有可能漏過在其他分析物濃度水平上有臨床意義的干擾。,干擾實驗的判斷標準,干擾實驗的判斷標準,4.干擾物檢測濃度 決定一種物質在“最壞情

14、況”的條件下是否會產生干擾，干擾篩選應該在實驗室期望觀察到的最高濃度水平的病人樣本中進行。 5. 潛在的干擾物質,干擾分析前的質量保證,在進行一個干擾實驗之前，必須進行：培訓和熟悉精密度確認--EP5《臨床生化設備性能的精密度評價》 準確度確認 --EP9 《利用病人樣本進行方法學比較和偏倚評估》 攜帶污染評價質量控制--C24 《內部質量控制實驗：原理和定義》 標準化防范—M29 《實驗室工作人員避免職業(yè)感染》 安全性

15、和廢物處置--參照廠商的標簽和材料安全數(shù)據表（MSDS）,干擾測定（Determination of interference characteristics),第一種方法：評價潛在的干擾物添加到樣本后的干擾效應（干擾篩選）第二種方法：評價個別有代表性的病人結果與高特異性的比較方法的結果偏倚（用病人標本評價干擾）,干擾篩選,將陽性干擾物加入測定樣品中，與不加的對照組比較有無偏移，稱為“配對差異”實驗。一般最有效的方法是在較高濃度下對系

16、列可能的干擾物作初步篩選，如果臨床顯著意義，則該物質不是干擾物，無須進一步實驗。反之，具有臨床顯著意義的，應進一步評價以確定干擾物濃度與干擾程度間的關系，這類實驗稱為“劑量效應”（dose－response）實驗,實驗設計,1. 測試組和對照組在同一個分析批內完成；2. 計算重復測量次數(shù) ：有臨床意義的最小差異值；假設檢驗水準；重復性（批內精密度）。,實驗材料,1 基礎標本（Base pool） 從幾個健康的、沒有

17、進行藥物治療的個體獲得適當類型（血清、尿等）的新鮮樣本，基礎樣本應能反映樣本基質，能反映分析物的特點 。 合適的冰凍或凍干樣本 ，確認測試材料是否與臨床樣本相似 計算所需樣本量 測定基礎標本中分析物的濃度并用合適的純物質調整測 試管的分析物濃度到醫(yī)學決定濃度，應避免加入分析物時引入其他物質，推薦的分析物測試濃度見附錄 B。,實驗材料,2. 貯存液 獲得合適而純的潛在干

18、擾物，或者該物質最接近體內循環(huán)狀態(tài)的形式 選擇一種能夠充分溶解分析物的溶劑 盡可能小地稀釋樣本基質，最好小于5%。如果溶解度允許，通常配制成濃縮的20倍的貯存溶液有機溶劑需要特殊的對待 ，氯仿至少要求 1：100 的稀釋倍數(shù)，乙醇濃度大于1～2％時能夠使抗體變性。,3. 對照樣本用制備貯存液相同體積的溶劑替代測試干擾物 ，其他要求與測試樣本相同。 如果對照樣本中存在測試物質（比如膽紅素），使用合適的分析方法確定它的

19、濃度。 如果對照樣本中被分析物濃度與基礎樣本中明顯 的不相符，考慮溶劑為潛在的干擾物。,實驗材料,重測次數(shù)要求,重測次數(shù)取決于統(tǒng)計學假設水準 當有效假設檢驗不能確定干擾的方向（正的或負的）時使用雙側檢驗， 當有效假設檢驗包括干擾的方向（正的或負的）時使用單側檢驗,重測次數(shù)要求,雙側檢驗：Z1-??/2：100( 1－ß )% 的置信水平，z1－ß

20、; ：100（1－ß）％ 檢驗效能，s 是重復性標準差。d max 是分析物在測試濃度范圍內的最大允許干擾。單側檢驗： 用Z 1-?代替 Z1-?/2,z百分位值：,重測次數(shù)要求,z百分位值：舉例： 檢測可接受干擾程度為1.5 mg/dL 的干 擾效應，95％（?＝0.05）檢驗水準時，重復性（批內精密度）為1.0mg/d L , 計算重復次數(shù)：,重測次數(shù)要求,批內標準差（d max/s）的

21、倍數(shù) ： 95％（?＝0.05）檢驗水準時檢測不同的干擾效應所需的重測次數(shù)如下：,重測次數(shù)要求,批內標準差（d max/s）的倍數(shù) ：舉例在1mg/dL 肌酐濃度水平，批內重復測定的標準差為0.075 mg/dL，實驗室認為 0.1mg/dL是一個有意義的干擾。需要測定多少次，可能干擾能被檢測到？首先，把不精確度表述為批內重復測定的標準差的倍數(shù)： 0.1mg/dL/0.075 mg/dL =1.33 。將1.33向前舍

22、入一位為1.3，上表決定重復測定次數(shù)，得出在95％（?＝0.05）檢驗水準時，每個對照和測試樣品需要重復測定16次。,重測次數(shù)要求,實驗程序,“配對差異”實驗： 1) 合適的分析物濃度；2) 建立有臨床意義差別的標準（d max ）；3) 確定每個樣品所需的重復測量次數(shù)；?4) 準備臨床基礎標本；5) 準備20倍的濃縮貯存液（潛在干擾物），如果使用另外一種濃度）確定，按照步驟6和8稀釋（推薦濃度見附表C）;,6)用吸

23、管吸取1/20容器體積的濃縮貯存液到 容量瓶中，稱為測試樣品，7)用基礎液補足到刻度體積，充分混勻；8)用吸管吸取1/20容器體積的制備貯存液的 溶劑到第二個容量瓶，稱為對照樣品。9)基礎液補足體積，充分混勻；10)準備能夠被n整除的測試樣本和對照樣本，重復測定次數(shù)n由第三步確定；,實驗程序,11)按交互的順序分析測試（T）和對照（C）樣本； 如果檢測系統(tǒng)受攜帶污染影響，增加額外的樣本使對照樣本免受來自測試樣本攜帶

24、污染的影響。 增加的額外對照樣品Cx結果應舍棄。12)記錄結果，進行數(shù)據分析。,實驗程序,數(shù)據分析,.1 計算觀察到的干擾效應的“點估計”，即dobs ，是測試樣本均值和對照樣本均值之間的差值。,2 計算cut-off 值ｄc （雙側檢驗）,ｄnull是無效假設規(guī)定的值，通常＝0 ，對于單側檢驗，用 Z1－? 取代 Z1－?/2 。,3.計算95 ％ 置信區(qū)間的干擾效應95 ％置信區(qū)間＝,數(shù)據分析,s是測量方

25、法重復性的批內精密度，n是每個樣本的重復測量次數(shù)，t0.975 n-1為 t 檢驗數(shù)值表中97.5%和 n-1 的自由度時的值（n > 30，2.0是t0.975 n-1的合理近似值）。,結果解釋,如果點估計dobs值小于或等于cut-off值dc，可以得出某種物質引起的偏倚小于d max；否則，接受有效假設，說明由該物質引起干擾的假設成立。,當解釋干擾測試結果時考慮以下情況：由于吸樣錯誤，真實的干擾可能不同于觀察到的“點估

26、計”。如果無效假設成立，置信限100（1－?）％接受它；如果有效假設檢驗成立， 置信限100（1－ß）％ 接受它。相反置信限分別為 100 ? ％ 和 100 ß ％ 。如果被檢物為非人血清成分檢測，可能會引入人造物品的誤差 測試濃度的隨意選擇可能不顯示干擾,結果解釋,當一種或多種分析物的濃度出現(xiàn)干擾效應，則可通過劑量效應曲線確定不同干擾物濃度干擾程度，干擾物不同濃度可通過最高值干擾物濃度樣本和對照樣本混合制備。

27、一般情況下，做劑量效應曲線時每個測試濃度水平重復測量三次足夠。如計算每個濃度所需的重復測量次數(shù)，也可用附錄中公式計算。,“劑量效應” 實驗,測試材料,1.基礎標本2. 貯存液3.高濃度樣本---用基礎標本稀釋貯存液，制備成所 需的濃度。4.低濃度樣本 準備一組低的含平均濃度的干擾物的臨床樣本，在大多數(shù)情況下，治療

28、藥物，或血紅蛋白、膽紅素可以忽略不計，低濃度樣本的制備可參照對照樣本的制備方法,測試材料,5. 測試樣本---制備一系列不同濃度的干擾測試樣本，通常五個濃度足夠確定一個線性的劑量效應關系。,劑量效應實驗程序,1)測定待測的最高和最低標本濃度水平；2)確定被認為“有臨床意義”差別，如果曾做過“配對差異”實驗，這一步已經完成；3)確定在每個濃度重測次數(shù) n（見附錄 E ），通常3次；4)準備高中低系列濃度樣本；,劑量效應實驗程序,5）

29、 按照第三步n值的大小準備每份標本量；6） 在同一分析批之內檢測5個樣本的濃度，第一組按照升序測定各樣本，第二組按降序測定，第3組按照升序等等，平均系統(tǒng)漂移影響；或按隨機順序檢測所有樣本，達到最小化漂移效應；7） 計算低濃度樣本的平均值，其他各組結果中減去該低濃度樣本的平均值，然后把最終凈結果填入表格中進行數(shù)據分析。,數(shù)據分析,將結果點在圖上，y軸為干擾結果，x軸上為干擾物濃度，觀察劑量效應關系曲線的形狀：

30、 線性效應 非線性效應,線性效應,數(shù)據隨機分布，大約成一條直線，用最小二乘法進行回歸分析，在圖上劃出回歸直線，確定適合所有數(shù)據點，其效應曲線是線性。,與干擾物濃度相關線性干擾舉例：,線性效應,五個濃度水平的劑量效應線性關系結果,線性效應,劑量效應回歸分析,線性效應,,線形回歸的95%可信區(qū)間范圍,從干擾物濃度與置信區(qū)間改變大小的函數(shù)可以看出，在95%置信區(qū)間內結果最可信的是中間干擾物濃度

31、范圍,非線性效應,干擾物濃度的干擾可能不是一個線性函數(shù)，如果繪圖的數(shù)據顯示是彎曲的，那么對一個給定的干擾物濃度的干擾程度的適當估計可以用圖解形式表示 。,舉例：,非線性效應,五個系列濃度劑量響應非線性結果,非線性效應,,非線性劑量效應回歸分析 任何濃度水平的干擾物的干擾程度能夠從圖表中被估計，也可以用非線性回歸方程計算。,回歸線斜率代表每單位干擾物的偏倚，y軸上的截距表示內源性干擾濃度的校正，通過回歸方程或者圖表，任何干擾

32、物濃度水平的干擾程度都可被估計。如果斜率是正的，實驗顯示該物質引起一個正的干擾。,結果解釋,分析物和干擾物聯(lián)合評價,在單一的實驗中，干擾物濃度和分析物濃度在檢測過程中有組織設置，兩個或更多潛在干擾物能被更有效同時檢測，單一成分的干擾效應可通過單因素分析方法評估，多因素實驗設計描述，參見Box和Hunter文獻。 優(yōu)點：提高效率和提供更多的信息，干擾物質之間及干擾物與分析物之間的相互作用都能被評價。不足之處是樣本準備更加復雜，增加了人為

33、誤差發(fā)生的可能性。,干擾篩選的局限性,在臨床標本中的真實干擾物可能不是原來的藥物，而是代謝產物。實驗標本基體并不代表典型的有問題的臨床標本。加入的物質與臨床標本中的干擾物不相同，例如，蛋白結合、沉淀，或不均一性（異質性）。實驗水平可能選擇得太高或太低以至不真實。,干擾測定第二種方法： 用病人樣本評價干擾,第一種方法不論考慮多么全面，在病人的血清標本中可能遇到意想不到的干擾。為了最大程度的減少這種情

34、況的發(fā)生，應該分析來自病人的真實標本以評價內在的不同血清標本間的變異性。如果某個標本中出現(xiàn)一個可重復的“離群值”，則說明該標本中有未知的干擾物質存在。,實驗設計,被評價的方法和參考方法（或者其他被認定合格的比較方法）同時測定兩組病人樣本（測試組和對照組），如果測試組與對照組結果出現(xiàn)有意義的偏倚，存在干擾。參考方法或比較方法對干擾物有低敏感性。,測試標本,選擇原則：疾?。ɡ?，來自心臟病、肝病或腎病病人的標本）；藥物（例如，使用過

35、某種想了解的藥物的病人標本）；其他不正常組分（例如，具有不正常膽紅素、脂質、血紅蛋白或蛋白的標本）。,對照標本,選擇原則：沒有使用目標藥物；潛在干擾物質在正常濃度范圍內；相同或者相似診斷；分析物分布狀態(tài)與測試標本相似；對照樣本必須包括在每一分析批內。,實驗程序,1. 計算測試標本和對照標本數(shù)，取決于：兩種方法精密度；干擾效應的大?。灰?guī)定的假設檢驗水準。 2.挑選測試組和對照組標本；3.選擇合適的參考方法或者效果較好

36、的比較方法；,4. 在盡可能短的時間內（通常在兩個小時內），用兩種方法重復測定每個樣本。 5.如果觀察到偏倚存在，測定樣本中藥物或者其他潛在的干擾物質的濃度，如果可能的話，確定偏倚和干擾物濃度兩者之間的關系。,實驗程序,數(shù)據分析,計算測試組和對照組平均值之間的差值，并與干擾標準進行比較，然后確定干擾能否被排除或者需要進一步的研究。,1. 與比較方法結果作偏倚圖計算重復測定結果的均值；計算每個樣本平均偏倚（測試方法結果減去比較方法

37、結果）；作圖：偏倚在垂直軸上，比較方法濃度在水平軸，測試和對照樣本用不同的記號標識；通過線性回歸分析計算每一組的Sy,x 統(tǒng)計量（比較方法＝x），它可用于計算95％置信區(qū)間。,數(shù)據分析,2. 可能干擾的偏倚評估：,數(shù)據分析,（A）相對于對照組的正偏倚 (B) 相對于對照組沒有偏倚－成比例的方法偏倚 (C) 相對于對照組的負的偏倚 (D) 相對于對照組沒有偏倚,3.以潛在干擾物繪制偏倚曲線

38、 如果病人標本中可疑干擾物的濃度已知，可以判斷它是否與獲得的偏倚相關 。,數(shù)據分析,一種與潛在干擾物濃度相關很好的干擾效應,用病人樣本評價干擾---局限性,（1）對實驗變異缺乏控制對照（2）本方法并不能確定原因與作用的關系，它只能說明偏倚與估計干擾物某水平的相對關系（3）如果標本不新鮮，將會失去某些易變組分（例如，乙酰乙酸、CO2等 ）,用病人樣本評價干擾—局限性,4）病人通常用多種藥物，因此，難于證實何種藥物的干擾作用5)

39、 按疾病和用藥對病人分類，不是不可能，至 少對許多實驗而言是非常困難的6) 實驗是一種機遇，成功取決于在檢測的病人人群的標本中是否有此干擾存在,7) 很少有公認的參考方法。有的參考方法難以在常規(guī)實驗室中使用。另外，參考方法可能也同樣的被干擾。 無論怎樣，第二種方法對證實干擾物是有用的，這也是唯一的方法可檢出藥物代謝物干擾作用，它也可肯定在真實標本中有干擾的方法。,用病人樣本評價干擾---局限性,建立、確

40、認和驗證干擾聲明,EP7-A可被廠商用于驗證和確認特異性，建立干擾聲明，臨床實驗室也可用它檢驗廠商的聲明以及確認方法的特異性是否滿足醫(yī)學要求。,干擾聲明,對于商業(yè)方法來說，已知的干擾物質應在使用明書中闡述，實驗證明沒有干擾的物質也應該闡述，以便實驗室能夠驗證某種方法對它所服務的病人群體的適應性,干擾聲明---舉例1,1.干擾物系列濃度的結果 按照 EP7文件，對 AST方法進行干擾評價。當下列這些物質添加到血清中時，在顯示的濃度水平處

41、產生干擾，偏倚超過10％考慮為干擾。,干擾聲明---舉例2,2.膽紅素方法－兩個水平的干擾篩選 按照EP7文件，對膽紅素測量方法進行干擾評價，當血清中分析物和干擾物濃度達到表中所顯示濃度時，以下物質產生干擾，偏倚超過0.2mg/dL考慮為干擾。,確認干擾聲明,干擾和特異性聲明可用實驗方法確認，合適的方法依賴于聲明類型。聲明類型：（1）最大干擾聲明（干擾小于一個規(guī)定的最大值 ）（2）實測干擾聲明（1 mg/dL

42、鎂存在時，正常血清標本組 鈣離子濃度比對照組高0.14 mg/dL ）（3）非定量干擾聲明（據報道甲氨蝶呤對該方法可產生干擾 ）（4）特異性聲明（水楊酸鹽對該方法不產生干擾 ）,調查與臨床不一致的病人結果,每個實驗室偶爾會遇到與臨床不一致的結果，該結果可能被臨床醫(yī)生認為與診斷不相符或者與以前結果不一致，或者在實驗室內兩種方法檢測的結果有差異。 如果實驗室對一個特定病人的結果的差異可被重復，且該方法符合標準，那