生化實驗血糖的測定

1、血糖的測定,正常人空腹血糖濃度是多少？為何能保持恒定？糖尿病,正常人空腹血糖濃度(fasting plasma glucose,FPG)為 3.89-6.11 mmol/L。,血糖如何維持穩(wěn)定？關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶如何調(diào)節(jié)：激素調(diào)節(jié)。常見的升高血糖的激素：胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。降低血糖的激素：胰島素,對糖代謝的調(diào)節(jié)：胰島素促進組織、細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，加速葡萄糖合成為糖原，貯存于肝和肌肉中，并抑制糖異生，促進葡

2、萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅?，貯存于脂肪組織，導(dǎo)致血糖水平下降。胰島素缺乏時，血糖濃度升高，如超過腎糖閾，尿中將出現(xiàn)糖，引起糖尿病。,胰島素是促進合成代謝、調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的主要激素,如果調(diào)節(jié)失衡，結(jié)果是什么？高血糖或者低血糖。低血糖：生理性和病理性。低于2.8 mmol/L。,高血糖：生理性和病理性。高于7.1 mmol/L。高于8.89 mmol/L，出現(xiàn)糖尿。最常見病理性高血糖：糖尿病。糖尿病：高血糖和糖尿。臨床特點：三多一少。病因：胰島素分

3、泌缺陷和胰島素受體缺陷。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)？,糖尿?。╠iabetes）是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點，典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀，糖尿?。ㄑ牵┮坏┛刂撇缓脮l(fā)并發(fā)癥，導(dǎo)致腎、眼、足等部位的衰竭病變，且無法治愈。,糖尿病的類

4、型,Ⅰ型糖尿病又叫青年發(fā)病型糖尿病或胰島素依耐型糖尿病。原因：胰腺產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞已經(jīng)徹底損壞,從而完全失去了產(chǎn)生胰島素的功能.治療：依賴胰島素治療。,Ⅱ型糖尿病又叫非胰島素依耐型糖尿病。原因：自身能夠產(chǎn)生胰島素，但細(xì)胞無法對其作出反應(yīng)，使胰島素?zé)o法發(fā)揮作用。治療：需要胰島素單獨或與口服藥聯(lián)合應(yīng)用的治療,一般正常人進食后血糖都會暫時性升高，進食后30分種或60分種可升到最高峰，但血糖一般不超過8.9 mmol/L；進食2小時

5、后又會回到空腹水平，這就是人體對糖的耐受現(xiàn)象。什么是口服葡萄糖耐量試驗（Oral glucose tolerance test， OGTT）？有何臨床意義？,口服葡萄糖耐量試驗（Oral glucose tolerance test， OGTT）是一種口服葡萄糖負(fù)荷試驗，用以了解人體對進食葡萄糖后的血糖調(diào)節(jié)能力。通過OGTT試驗，可以早期發(fā)現(xiàn)糖代謝異常，早期診斷糖尿病(Diabetes Mellitus, DM) ，是一種簡單、快

6、捷的診斷方法。,實驗前三天，受試者每日食物中糖含量不應(yīng)低于150g，且維持正?；顒?，影響試驗的藥物應(yīng)在三天前停用，受試前應(yīng)空腹10-15h。 空腹取血后，5分鐘內(nèi)飲入250ml含75g無水葡萄糖的糖水，妊娠婦女用量為100g，兒童按1.75g/kg體重給予,不超過75g。 服糖后半小時，1小時，2小時，3小時各抽血一次，作血糖定量檢測。于采血同時，每隔1小時留取尿液作尿糖試驗，整個過程不可吸煙，喝咖啡，喝茶或進食。,OGTT方法

7、：WTO標(biāo)準(zhǔn)化,測試前禁食10-16小時，清晨空腹進行?？崭钩殪o脈血，測空腹靜脈血漿葡萄糖，然后成人口服75 g無水葡萄糖，溶于250 ml水中，5~10分鐘內(nèi)飲完。飲后2小時抽靜脈血，測靜脈血漿葡萄糖。,IFG 與 IGT,空腹血糖損傷(Impaired Fasting Glucose, IFG)：空腹血糖≥6.1mmol/L,但＜7.0mmol/L糖耐量受損(Impaired Glucose Tolerance, IGT)：餐后2

8、h血糖＞7.8mmol/L,但＜11.1mmol/L,IFG 和IGT可以說是一種正常人向糖尿病的過渡狀態(tài)，這部分人雖然現(xiàn)在還不是糖尿病， 但是將來發(fā)生2型糖尿病的危險性非常高，可以說是糖尿病的后備軍。據(jù)有關(guān)研究報道，每年5-8%的IGT者將發(fā)展成為2型糖尿病。,無糖尿病史，空腹或者隨機血糖異常無糖尿病史，有一過性或持續(xù)性糖尿無糖尿病史，有明顯糖尿病家族史有糖尿病癥狀，但空腹或者隨機血糖不夠標(biāo)準(zhǔn)分娩巨大胎兒的婦女和有巨大胎兒史的

9、個體不明原因腎病和視網(wǎng)膜病妊娠期、甲亢、感染期出現(xiàn)糖尿者,OGTT的適應(yīng)癥,血糖測定方法,無機化學(xué)法：如Folin-Wu法有機化學(xué)法：如鄰甲苯胺法酶法：己糖激酶法，酶法：葡萄糖氧化酶法,原理葡萄糖在和堿性銅試劑混合加熱后，可使 Cu2+還原成Cu+ ，后者與磷鉬酸試劑作用生成藍色的鉬藍。通過比色法測定藍色化合物，計算出血糖的含量 穩(wěn)定、準(zhǔn)確、但對葡萄糖無特異性，受血中非糖還原物質(zhì)的影響?？崭拐Ｑ菂⒖贾?4.4~6

10、.7mmol/L或80-120mg/dL,無機化學(xué)法：Folin-Wu法,有機化學(xué)法：鄰甲苯胺法,原理：葡萄糖為一含醛基的已糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥甲基-2-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的Schiff堿。Schiff堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比。評價：操作簡便，由于鄰甲苯胺只與醛糖作用而顯色，故此種測定法不受血液中其他還原物質(zhì)的干擾，測定時也無需去除血漿或血清中的蛋白質(zhì)，因此該實驗的特異性較高。,酶法

11、：己糖激酶法（Hexokinase, HK）,原理：,NADPH在340nm有吸收峰，其吸光度增加與標(biāo)本中的葡萄糖濃度成正比。,評價：　　本法特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分析，為葡萄糖測定的參考方法，但是試劑較貴。,酶法：葡萄糖氧化酶法（glucose oxidase, GOD）,葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)利用氧和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶 (perox

12、idase，POD)作用下，分解為水和氧的同時將無色的4-氨基安替比林與酚氧化縮合生成紅色的醌類化合物。紅色的深淺在一定范圍內(nèi)與葡萄糖濃度成正比，在510nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血糖的濃度。,葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法原理,（1）葡萄糖＋O2＋H2O,,葡萄糖氧化酶（GOD）,（2）H2O2＋4-氨基安替吡啉＋苯酚,葡萄糖酸＋H2O2,H2O ＋紅色醌式物質(zhì),過氧化物酶（POD）,,Trinder反應(yīng),505nm,

13、光吸收法測定,,相對血糖濃度,實驗試劑,0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)酶試劑 取過氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，疊氮化鈉100mg，溶于磷酸緩沖液80ml中，定容至100ml，置4℃保存酚溶液 稱取重蒸餾酚100mg溶于蒸餾水100ml中，用棕色瓶貯存。酶酚混合試劑 將酶試劑和酚試劑等量混合，4 ℃下可存放1個月。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：5mmol/L,實驗操作,混勻，置 37 ℃

14、水浴保溫 15分鐘，每管加蒸餾水0.5 ml，在510nm波長處比色，以空白管（B管）調(diào)零，讀取各管吸光度。根據(jù)各管吸光度計算其血糖濃度。,葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液的葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。這是因為尿液中的尿酸等干擾物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。對于血液樣品需及時分離紅細(xì)胞。因為紅細(xì)胞的酵解將會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。建議測定樣品以草酸鉀-氟化鈉為抗凝劑以抑制糖酵解。,注意事項,嚴(yán)重黃疸、溶血

15、及乳糜樣血清先制備無蛋白血濾液，然后在進行測定。酶酚混合液一般現(xiàn)用現(xiàn)配。 葡萄糖氧化酶對 β - D 葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約 36% 為 α 型， 64% 為 β 型。葡萄糖的完全氧化需要 α 型到 β 型的變旋反應(yīng)。葡萄糖變旋酶，可加速這一反應(yīng)，延長孵育時間可達到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是 α 型，故須放置 2h 以上 ( 最好過夜 ) ，待變旋平衡后方可應(yīng)用。,注意事項,計算：,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：5 mm

16、ol/L血清葡萄糖（mmol/L）=AT/AS ×CS,參考值：,3.9~6.1 mmol/L,不同檢測方法所提供的空腹正常血糖參考值存在差異。葡萄糖氧化酶法：3.9~6.1mmol/LFolin-Wu法：4.4~6.7mmol/L鄰-甲苯胺法：3.9~6.1mmol/L,本法測定葡萄糖非常特異，從原理反應(yīng)式中可知第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素 C 、膽紅素

17、和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，產(chǎn)生競爭性抑制，使測定結(jié)果偏低。但是對測定結(jié)果無顯著影響。,實驗誤差分析：,葡萄糖氧化酶法：該法特異性高，反應(yīng)條件溫和，能反映血中葡萄糖的真實含量，且已推廣出試劑盒，廣泛應(yīng)用與臨床。 Folin-Wu法：該法對葡萄糖無特異性，一切還原物質(zhì)均可產(chǎn)生同樣的反應(yīng)。雖血液中葡萄糖為主要還原物質(zhì)，但仍存在其他非糖還原物質(zhì)，故該法其參考值較其他方法略高。鄰-甲苯胺法：