糞便病原菌的分離與鑒定

1、1,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,糞便標(biāo)本中常含有很多雜菌，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康木牟煌x擇培養(yǎng)基，以利于病原菌的檢出。而且，因其各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無(wú)法分辨是否為病原菌。常見(jiàn)的病原菌有志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。 這次實(shí)驗(yàn)中我們從糞便標(biāo)本中檢出的是大腸埃希菌、痢疾志賀菌。而且，我們從這次的綜合性實(shí)驗(yàn)中了解到了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握

2、了微生物試驗(yàn)的基本技能和基本原理，樹(shù)立了牢固的無(wú)菌觀念。同時(shí)培養(yǎng)了我們的動(dòng)手能力和表達(dá)能力。,2,糞便標(biāo)本,,,直接糞便檢查,,革蘭染色單染色動(dòng)力觀察及制動(dòng)試驗(yàn),,初步結(jié)果報(bào)告,,需氧培養(yǎng),,,,增菌培養(yǎng),直接分離,,,,,,,,,,,,,,,,,,堿性胨水,堿性平板分離,菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng),增菌液,,菌落形態(tài)抗血清凝集生化反應(yīng),SS平板,,副溶血性弧菌選擇性平板,菌落形態(tài)生化反應(yīng),厭氧培養(yǎng)微需氧培養(yǎng)及特殊培養(yǎng),,,實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果,3,,1.實(shí)驗(yàn)材料,接種針、接種環(huán)、油性筆、打火機(jī)、試管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21型 生物顯微鏡、1500W電爐、蒸餾水、玻片缸、消毒液、1‰新潔而滅、天平、砝碼、細(xì)菌干粉培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂）、錐形瓶、量筒、試管筐、糖發(fā)酵微量管（葡萄糖、乳糖）、滅菌平皿、試管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、稱(chēng)量紙、硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋、尺子、藥勺、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95％乙醇、

4、稀釋石炭酸復(fù)紅）、小砂輪、痢疾血清、青霉素、鏈霉素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片、線繩、香柏油、擦油紙,4,,,2.實(shí)驗(yàn)方法,2.1培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌培養(yǎng)基制備的一般程序：調(diào)配→溶化→ 矯正pH →分裝→滅菌→檢定→保存。 干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→滅菌→檢定→保存。干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好 →放入講臺(tái)邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)→送到高壓滅菌室（洗

5、刷室）。,5,表1.培養(yǎng)基的制備,6,2.2細(xì)菌的分離與培養(yǎng),2.2.1采用平板劃線分離法，將取糞便標(biāo)本中混雜的多種細(xì)菌，在伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基表面劃線，使之分散成單個(gè)細(xì)菌，在37℃培養(yǎng)24h，從而分離出肉眼可見(jiàn)的單個(gè)菌落。 2.2.2細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察。觀察形成菌落的大小、形狀、邊緣、表面、溶血性、色素、透明度、濕潤(rùn)度。2.2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落。挑選這兩種不同菌落

6、分別在斜面培養(yǎng)基上接種，標(biāo)記，在37℃培養(yǎng)18h。2.2.4細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)量、菌苔形狀、表面形狀、光澤、透明度、顏色等。2.2.5液體培養(yǎng)基接種法。用接種環(huán)在固體或斜面培養(yǎng)基上挑選紫黑色和粉紅色菌苔少許移入液體培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混勻。在35℃培養(yǎng)4~6h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,7,2.3細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征的觀察,2.3.1取兩塊玻片，在每塊

7、玻片上加生理鹽水3～4ul，2滴，在斜面培養(yǎng)基上取紫黑色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第一塊玻片上的一滴鹽水混勻，再取粉紅色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第二塊玻片上的一滴鹽水混勻，涂成1cm2；做好標(biāo)志。經(jīng)在空氣中干燥后，再用酒精燈對(duì)其進(jìn)行固定。2.3.2革蘭染色。用結(jié)晶紫對(duì)以上兩塊已固定的玻片進(jìn)行初染1分鐘，水洗；再用盧戈碘液媒染1分鐘，水洗；然后用95％乙醇對(duì)其進(jìn)行脫色約20秒鐘，水洗；最后用稀釋復(fù)紅復(fù)染1分鐘，水洗；吸干，

8、在顯微鏡下鏡檢。,8,2.4細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定,2.4.1糖發(fā)酵試驗(yàn)。用接種針?lè)謩e挑少許紫黑色和粉紅色的細(xì)菌接種到葡萄糖發(fā)酵微量管和乳糖發(fā)酵微量管中，將微量管放在平皿蓋內(nèi)，在37℃下，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。2.4.2細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)。接種環(huán)分別取紫黑、粉紅色兩種菌液3～6ul×2環(huán)，各自在兩個(gè)平板上，作平板密集劃線接種細(xì)菌（紗窗樣）。設(shè)計(jì)三點(diǎn)，三點(diǎn)之間等邊三角距離，點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)記：青、鏈、慶。鑷

9、子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。37℃18～24小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。2.4.3半固體接種法。接種針斜面取紫黑和粉紅色的細(xì)菌，各自接種進(jìn)兩個(gè)半固體培養(yǎng)基，從半固體培養(yǎng)基中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部4/5處，再循原來(lái)的路線，退出接種針。 在37℃下,培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。2.4.4 痢疾血清玻片凝集反應(yīng)。取載玻片1張，滴加痢疾血清和生理鹽水各15ul，2滴。用接種環(huán)挑取少許紫黑色菌落和粉

10、紅色菌落，各自與上述混合液液滴混勻，觀察結(jié)果,9,,3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果,3.1細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察。將糞便標(biāo)本用平半分區(qū)劃分法接種于伊紅美蘭培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)出紫黑色和粉紅色兩種菌落。(見(jiàn)圖一),10,,3.2革蘭染色鏡檢。取紫黑色和粉紅色菌涂片，革蘭染色，進(jìn)行鏡檢。紫黑色菌革蘭染色陰性，長(zhǎng)桿狀。粉色菌革蘭染色陰性，短桿狀。（見(jiàn)圖二，圖三）,11,3.3糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和半固體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)。紫黑色菌兩支單糖發(fā)酵微量管均變色和產(chǎn)氣，粉紅色

11、菌葡萄糖發(fā)酵管變色不產(chǎn)氣泡，乳糖發(fā)酵管既不變色也不產(chǎn)氣泡。半固體實(shí)驗(yàn)中，紫黑色菌成模糊狀，粉色菌成清晰的線狀。（結(jié)果見(jiàn)圖四，圖五，表二）,12,表2、糖發(fā)酵試驗(yàn)和半固體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌種類(lèi) 葡萄糖 乳糖 半固體紫黑色菌 ⊕ ⊕ + 粉紅色菌 +

12、 - - 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：說(shuō)明紫黑色細(xì)菌均能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，粉色菌能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。紫黑色菌有鞭毛，粉紅色菌無(wú)鞭毛。,13,2.4藥敏試驗(yàn)。使用紙片瓊脂擴(kuò)散法，觀察抑菌圈的大小，由此判斷兩種菌的藥物敏感性（現(xiàn)象見(jiàn)圖六，圖七。結(jié)果見(jiàn)表3）,14,,2.5痢疾血清玻片凝集實(shí)驗(yàn)。紫黑色菌與痢疾血清混合不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而粉紅色菌與痢疾血清混合出現(xiàn)凝集

13、現(xiàn)象，說(shuō)明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉紅色菌是引起痢疾的致病菌。,15,在制備好培養(yǎng)基后，采用是平板劃線分離法，將糞便標(biāo)本接種于伊紅美藍(lán)平板，從中分離出兩種不同的細(xì)菌：紫黑色具有金屬光澤的菌落和粉紅色半透明菌落。在顯微鏡下觀察時(shí)，這兩種菌均為G﹣桿菌，排列不規(guī)則，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)，可以觀察到，紫黑色的細(xì)菌使能使葡萄糖和乳糖的試管變色和產(chǎn)生氣體，粉紅色的細(xì)菌只能使葡萄糖的試管變色而無(wú)氣體，對(duì)乳糖無(wú)反應(yīng)；經(jīng)半固體

14、動(dòng)力試驗(yàn)，觀察到紫黑色的細(xì)菌使半固體培養(yǎng)基成渾濁狀態(tài)，粉紅色的細(xì)菌只在接種針插入的方向聚集。由此初步推斷，紫黑色的細(xì)菌可能為大腸埃希菌，粉紅色的為痢疾志賀菌（參見(jiàn)表四和表五）。進(jìn)行痢疾血清玻片凝集實(shí)驗(yàn)，紫黑色菌無(wú)凝集現(xiàn)象，粉色菌有凝集現(xiàn)象，因此可以斷定粉色菌為痢疾志賀菌，紫黑色菌極可能為大腸埃希菌。做藥敏試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌和痢疾志賀菌均對(duì)青霉素不敏感，對(duì)慶大霉素和鏈霉素都敏感。,16,,,,THE END!,謝謝觀賞！,17,18,