桑椹菌核病病原菌的分離、鑒定及其拮抗性桑樹內生菌的研究.pdf

1、桑椹菌核病俗稱白果病，根據(jù)病原及病癥的不同，將其分為三類：桑椹肥大性菌核病、桑椹縮小性菌核病及桑椹小粒性菌核病。不同類型桑椹菌核病雖然病原菌不同，但侵染循環(huán)基本一致，且病害遍布全國各地，給果桑產(chǎn)業(yè)造成極大的危害。目前，桑椹菌核病主要是采用化學農(nóng)藥和農(nóng)藝措施進行防治。然而，農(nóng)藝措施防效甚微，化學農(nóng)藥的過量使用不僅使病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且?guī)磙r(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、威脅桑果食用和桑葉養(yǎng)蠶等問題。因此亟需尋找新的安全、高效、環(huán)境友好生物防治方法。

2、
　　植物內生菌廣泛分布于陸生及水生植物體內，以植物為棲息場所。植物內生菌作為新型生防因子，能定殖于健康植物的各種組織和器官中，與植物建立和諧關系，并可通過合成抗菌活性物質、誘導植物抗性和促進植物生長等機制提高宿主植物抗病性。內生菌受環(huán)境條件的影響較小，能在植物體內長期定殖和傳導，發(fā)揮生防作用,已經(jīng)成為植物病害生物防治中潛在的生防菌而備受重視。
　　本文從發(fā)病桑椹和子實體中分離桑椹縮小性菌核病病原菌和桑椹肥大性菌核病病原菌，

3、從形態(tài)學和分子生物學水平進行鑒定，并對其培養(yǎng)特性進行研究。進而以分離獲得的桑椹菌核病病原菌為靶標，從健康桑樹中篩選、鑒定具有顯著而穩(wěn)定拮抗作用的內生菌。并研究內生拮抗菌對桑樹種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，為利用桑樹內生菌進行桑椹菌核病的生物防治奠定研究基礎。本研究主要取得了以下結果：
　　1.桑椹菌核病病原菌的分離、鑒定和培養(yǎng)特性研究
　　從經(jīng)表面消毒的梭狀子實體及縮小性桑椹病椹中分離病原真菌，共獲得101個分離株，12株經(jīng)IT

4、S序列分析，及形態(tài)學研究，鑒定為蠟釘菌目（Helotiales）、地舌菌科（Geoglossaceae）、核地杖菌屬（Scleromitula）、桑椹核地杖菌（Scleromitula shiraiana）。其中Scleromitula shiraiana SXSG-5分離株的田間回接實驗發(fā)現(xiàn)，盛花期接種該菌菌絲的桑椹呈現(xiàn)出明顯的縮小性菌核病癥狀，且經(jīng)組織分離法再次獲得桑椹核地杖菌（Scleromitula shiraiana）。培養(yǎng)特

5、性研究結果表明，S.shiraiana SXSG-5能在多種培養(yǎng)基上生長，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和桑葉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長較快，在桑葉汁馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上有大量的菌絲，最適生長溫度為20℃，最適pH為6.0，光照對該菌生長的影響較顯著，全光照條件下菌株生長最快。
　　從經(jīng)表面消毒的盤狀子實體中分離病原真菌，得到27個分離株，11株經(jīng)ITS序列測定分析，及形態(tài)學觀察，鑒定為子囊菌亞門（Ascomycotina）、錘舌菌綱（L

6、eotiomycetes）、肉膜菌目（Helotiales）、核盤菌科（Sclerotiniaceae）、核盤菌屬（Sclerotinia）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。其中，Sclerotinia sclerotiorum PZ-2分離株的回接實驗結果表明，其能引起果桑肥大性菌核病，且經(jīng)組織分離法能再次獲得核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。Sclerotinia sclerot

7、iorum PZ-2菌株的培養(yǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)：該菌能在多種培養(yǎng)基上生長，其中在PDA、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、桑葉汁馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、桑葉汁瓊脂培養(yǎng)基上均生長迅速，3天即可布滿90 mm平板。病原菌在20℃到25℃范圍內生長最快，p H和光照條件對該菌生長影響不顯著。
　　2.拮抗菌的分離、鑒定、抑菌譜測試及培養(yǎng)特性研究
　　以分離獲得的桑椹菌核病病原菌S.shiraiana SXSG-5和S.sclerotiorum PZ

8、-2為指示菌，從健康桑樹的內生菌中篩選對其有顯著而穩(wěn)定抑制作用的菌株，并通過形態(tài)學和分子生物學特征的研究，完成拮抗菌的鑒定工作。
　　從健康實生桑莖中分離獲得一株內生菌SAJ-1，其三周培養(yǎng)物對桑椹核地杖菌Scleromitula shiraiana SXSG-5抑菌率為98.07％，對核盤菌Sclerotinia sclerotiorum PZ-2的抑菌率為93.42%，且抑菌作用穩(wěn)定。SAJ-1菌株在PDA、WA和 OA培養(yǎng)基

9、上培養(yǎng)12周，可在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器呈球形、扁球形，單生或叢生，頂部突起，具孔，大小98.0～126.9μm×158.3～186.0μm；分生孢子器細胞壁角形組織狀，呈黑色或褐色。在器壁的外表面有剛毛束，剛毛長30.8～93.1μm，剛毛近端細基部粗。分生孢子器破碎后可見分生孢子梗，蓮藕形，有隔膜，大小50.0～80.0μm×110.0～268.0μm，無分支；分生孢子透明，單胞，圓形或橢圓形，大小0.8～1.5μm×

10、2.3～3.1μm，且內部無滴狀斑點。經(jīng)28S rDNA序列分析顯示，SAJ-1菌株與絲座殼科（Cucurbitariaceae）棘殼孢屬（Pyrenochaeta）的Pyrenochaeta unguis-hominis（GQ387621）處于同一最小分支；ITS基因序列分析，SAJ-1與Pyrenochaeta sp.（EU885415）處于同一最小分支。將菌株SAJ-1的形態(tài)學特征與P.unguis-hominis比較發(fā)現(xiàn)，菌株S

11、AJ-1與P.unguis-hominis的分生孢子器及分生孢子的形態(tài)及大小較為相似，但分生孢子梗的大小、形態(tài)和分支方式，以及菌落在OA培養(yǎng)基上的形態(tài)相差較大，且分生孢子內部結構相差較大。根據(jù)分子生物學及形態(tài)學比較分析判斷菌株 SAJ-1屬于棘殼孢屬Pyrenochaeta sp.，命名為Pyrenochaeta sp.SAJ-1。
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1抑菌譜測試結果表明，其對西瓜炭疽病菌(Colletr

12、ichum lagenarium)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、榆枯萎病菌(Ceratocystis ulmi)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、褐斑病菌(Cercospora beticola)均具有良好的抑

13、制效果。培養(yǎng)特性研究表明，Pyrenochaeta sp.SAJ-1在燕麥培養(yǎng)基（OA）、CZA和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上生長較快，菌株的最適生長溫度為25℃，最適光照條件為12光照/12黑暗交替培養(yǎng)。
　　3.拮抗菌Pyrenochaeta sp. SAJ-1對桑樹種子萌發(fā)及桑苗生長的影響
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1對桑椹菌核病菌具有很好的拮抗作用，能否利用該菌株在田間防治桑椹菌核病，尚需探究其對桑樹生長

14、的影響。故本研究通過溫室盆栽實驗，研究不同稀釋倍數(shù)的Pyrenochaeta sp. SAJ-1菌株的菌絲體懸液、發(fā)酵上清液對桑樹種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。
　　種子萌發(fā)研究結果表明，菌絲體100倍和500倍稀釋液處理桑樹種子時，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于無菌水處理組，發(fā)芽勢分別提高40.54%和24.32%，發(fā)芽率分別提高23.91%和15.21%，其對桑樹種子的萌發(fā)具有良好的促進作用。利用SAJ-1發(fā)酵上清液原液、100倍和5

15、00倍稀釋液處理桑樹種子時，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均低于無菌水處理組，對桑樹種子的萌發(fā)具有抑制作用。上清10倍稀釋液處理桑樹種子時，種子發(fā)芽率與無菌水處理組基本一致。
　　Pyrenochaeta sp.SAJ-1對桑苗生長影響的研究結果顯示：菌絲體原液、10倍、100倍、500倍稀釋液均能增加桑苗的根尖數(shù)、根鮮重、單株鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重。其中以菌絲體10倍稀釋液處理效果最好，與無菌水對照組相比，根尖數(shù)、主根長、根鮮重

16、、單株鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重分別增加50.00%、27.92%、79.87%、112.76%、22.28%、141.71%。發(fā)酵上清液原液、10倍、100倍、500倍稀釋液能夠增加根的鮮重、地上部分株高和地上部分鮮重。其中以上清10倍稀釋液處理效果最好，與無菌水處理組相比，主根長、根的鮮重、單株鮮重、葉片長、葉片寬、地上部分株高和地上部分鮮重，分別提高3.33%、139.60%、77.89%、26.45%、52.50%、20.

17、27%、60.30%。進一步研究結果表明，Pyrenochaeta sp. SAJ-1菌株能通過產(chǎn)生IAA及溶解磷酸鈣而對宿主植物具有促生長作用，定量測定結果顯示，SAJ-1菌株產(chǎn)生 IAA的能力隨著培養(yǎng)時間的延長先增加，后趨于平穩(wěn)，且在培養(yǎng)至12天時IAA量達到峰值為13.16μg/mL。SAJ-1菌株在無機磷平板上可形成直徑為24.83mm的透明圈。經(jīng)測定在發(fā)酵至第7天，發(fā)酵上清液中磷含量達到最大值447.91μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，

18、上清液中的有效磷含量開始減少最后趨于平穩(wěn)。
　　綜上所述，本論文分離研究了桑椹縮小性菌核病病原菌S.shira iana SXS G-5菌株和桑椹肥大性菌核病病原菌S.sclerotiorum PZ-2菌株。篩選、鑒定了一株對兩種桑椹菌核病菌均有拮抗作用的桑樹內生菌Pyrenochaeta sp.SAJ-1菌株。該菌株對桑苗生長不僅無負面影響，且對桑樹種子的萌發(fā)及桑苗生長均具一定的促進作用，本研究取得的結果為桑椹菌核病的生物防治提