半夏軟腐病拮抗內(nèi)生菌的篩選及其鑒定.pdf

1、半夏軟腐病是由胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovora)引起的破壞性病害，發(fā)生普遍，發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅著半夏的規(guī)?；a(chǎn)。生物防治集安全、有效和持久等于一體，已成為一種重要的植病防治措施。近幾年，植物內(nèi)生菌作為一類新型的資源微生物，在替代或減少農(nóng)藥使用、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、保持植物微生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面日益受到重視，是當(dāng)前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。本論文將針對半夏軟腐病篩選半夏內(nèi)生拮抗菌，從而為

2、該中藥材的綠色防治技術(shù)開發(fā)奠定初步的基礎(chǔ)。 2006年6-10月從山東、浙江、四川和江西等省種植地采集半夏樣品135株，從這些樣品的根、球莖和莖部分別分離內(nèi)生菌，獲得細(xì)菌分離物790個、真菌分離物76個和放線菌分離物47個。對這些內(nèi)生菌在培養(yǎng)平板上進(jìn)行拮抗篩選，得到拮抗細(xì)菌45株、拮抗真菌3株和拮抗放線菌2株。其中15株拮抗細(xì)菌經(jīng)低溫保藏后，抑菌圈顯著減小或消失，故只對剩余的35株拮抗菌作進(jìn)一步研究。以半夏球莖及其切片為材料，對

3、35株拮抗細(xì)菌及拮抗真菌和放線菌進(jìn)行了拮抗篩選，結(jié)果：30株拮抗細(xì)菌中分別有19個和28個細(xì)菌顯著減輕半夏切片和球莖的軟腐病癥狀；3個真菌和2個放線菌完全抑制半夏切片和離體塊莖的軟腐病發(fā)生，防治效果為100％。細(xì)菌對半夏球莖的生防效果高于其在切片上的作用，可能的原因在于球莖更接近天然的植物內(nèi)生環(huán)境，有利于內(nèi)生菌的定殖、生長和發(fā)揮作用?？梢?，球莖作為拮抗篩選材料更能客觀反映內(nèi)生菌的作用。 選擇在球莖上具有較好生防效果(50％以上)

4、的拮抗菌繼續(xù)在半夏組培苗上進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果，4個細(xì)菌P-Y11T-3-1、L3R3-1、P-WXS2-3和P-H2T1-2顯著抑制組培苗的軟腐病菌發(fā)生，防治效果為80-95％；3個內(nèi)生真菌(SC6、SC7和JX11-2)和2個內(nèi)生放線菌(07JX3-2和07JX3-7)均能完全抑制組培苗的軟腐病發(fā)生，防治效果均為100％。進(jìn)一步驗(yàn)證這9個內(nèi)生菌對半夏植株的生防效果，結(jié)果在煉苗前接種拮抗細(xì)菌的半夏植株，其病情指數(shù)明顯低于煉苗后接種拮抗菌的植

5、株，生防效果較好的菌是P-Y11T-3-1和L3R3-1，它們對半夏植株軟腐病的生防效果分別為75％和70.83％。盡管內(nèi)生拮抗真菌和放線菌對半夏組培苗表現(xiàn)了很好的生防效果，但在半夏植株上的生防效果相對較差(0-35％)，這可能與它們在半夏植株和組培苗上的定殖能力不同有關(guān)。 定殖能力是生防菌發(fā)揮功能的重要因素。以3株拮抗效果較好(對植株防效為50％以上)的內(nèi)生細(xì)菌為對象，研究了它們在半夏組培苗上的定殖和生長動態(tài)。結(jié)果，接種12h

6、后就可在組培苗葉檢測到較高濃度的拮抗菌(106-8cfu/g-fw)，表明這些菌可在組培苗內(nèi)快速定殖和生長，1-3d內(nèi)達(dá)到最高濃度(108-9cfu/g-fw)；此后27d，3株拮抗菌在半夏組培苗呈現(xiàn)一種動態(tài)變化，但菌濃度保持在106-8cfu/g-fw。比較拮抗菌在組培苗各組織的分布情況，發(fā)現(xiàn)它們在根與球莖的數(shù)量顯著高于在葉片與地上莖的數(shù)量。拮抗細(xì)菌在半夏植株上定殖研究表明，在煉苗前接種拮抗菌的半夏植株的內(nèi)生菌濃度為105-107cf

7、u/g-fw；而在煉苗移栽后接種拮抗菌的植株內(nèi)生菌明顯較少，菌濃度僅為103-105cfu/g-fw?？梢姡跓捗缜暗慕M培苗期接種更利于拮抗菌的定殖和生長，這可能是適宜的生長條件和競爭性微生物缺乏的結(jié)果。這就為生防菌的應(yīng)用提供了一種新的方式，也為優(yōu)質(zhì)抗性半夏種苗的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。 應(yīng)用傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法對生防效果顯著的6個拮抗內(nèi)生菌進(jìn)行了初步鑒定。形態(tài)學(xué)、生理生化及16SrDNA序列分析表明：內(nèi)生拮抗菌P－Y11T-3

8、-1為假單胞菌屬銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；L3R3-1屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，其所屬種有待進(jìn)一步確定。形態(tài)學(xué)、生理生化以及ITS序列分析表明，菌株SC6和SC7均為半知菌亞門絲孢菌綱絲飽菌目叢梗孢科曲霉屬土曲霉(Aspergillusterreus)，兩者的ITS序列同源性為99.9％。形態(tài)特性和生理生化特征分析結(jié)果，內(nèi)生拮抗放線菌07JX3-2和07JX3-7屬于鏈霉菌屬(Strep