榨菜低鹽腌制體系中優(yōu)勢種群的分子鑒定及分析【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　榨菜低鹽腌制體系中優(yōu)勢種群的分子鑒定及分析</p><p>　　摘要：本文對我國蔬菜傳統(tǒng)腌制工藝過程中的最佳鹽度、主要微生物類群進(jìn)行了較為全面的論述,對提高蔬菜傳統(tǒng)腌制品的質(zhì)量有一定的指導(dǎo)意義。同時概述

2、了16S rDNA技術(shù)的原理及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用與研究進(jìn)展，并探討了這些技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用前景。</p><p>　　關(guān)鍵字：低鹽腌制；乳酸菌；16S rDNA</p><p>　　蔬菜的腌制加工，在我國已有悠久的歷史。勞動人民在長期生產(chǎn)實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。但是傳統(tǒng)的蔬菜腌制工藝均采用高鹽進(jìn)行腌制。這樣，成品鹽度太高，而食用過多的食鹽對人體某些器官會造成永久性損壞[1]。所以，我

3、國人民對高鹽腌制食品也越來越不歡迎，取而代之的低鹽方便的軟包裝腌制蔬菜產(chǎn)品正在占領(lǐng)市場[2]。</p><p>　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食品微生物的分子生物學(xué)研究進(jìn)入了一個新階段，人們對于微生物在分子和基因水平的認(rèn)識不斷深入。近年來，SSCP技術(shù)為已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于到環(huán)境和食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[3,4]。采用的SSCP方法體現(xiàn)了一種快速、簡易的研究微生物群落結(jié)構(gòu)的方法[5]，但是測序列較短，個別

4、可能只確定屬、科分類地位，無法精確地鑒定到種，所以結(jié)合16S rDNA/rRNA的序列分析來進(jìn)一步來進(jìn)行研究。16S rDNA或16S rRNA 序列既具有保守性, 又具有高變性, 是目前細(xì)菌分類和鑒定經(jīng)常使用的一種檢測方法[6,7]。</p><p>　　蔬菜低鹽腌制的最佳鹽度</p><p>　　一般來講，榨菜含鹽量愈高，愈有利于榨菜的保存，也有利于保持榨菜的香味和滋味。但由于高鹽度條

5、件下腌制的蔬菜含鹽量太高，食用過多的食鹽對人體的某些器官如腎脈和心血管系統(tǒng)等會造成永久性損壞。然而，榨菜含鹽越低，雖然可以保持蔬菜原有的營養(yǎng)成分，卻不利于榨菜的保質(zhì)貯存。并且在低鹽條件下勢必引起各種微生物的生長，因此，在此條件下使腌制保藏過程正?；倪^程是一個十分復(fù)雜的微生物學(xué)發(fā)酵過程，同時伴隨著復(fù)雜的生物化學(xué)變化和物理變化，搞清正常腌制過程的微生物的作用以及相應(yīng)的物質(zhì)變化關(guān)系[8,9]，對制訂合理的生產(chǎn)工藝實(shí)現(xiàn)蔬菜腌制的清潔生產(chǎn)提供技

6、術(shù)保證。李學(xué)貴[1]等通過研究總結(jié)出當(dāng)含鹽量為5%時為榨菜腌制的最佳鹽度。</p><p>　　2 蔬菜的低鹽腌制中的主要微生物</p><p>　　目前,我國各種蔬菜腌制品的發(fā)酵,都是借助于天然附著在蔬菜表面上的微生物的作用來進(jìn)行的。據(jù)測定,蔬菜收獲后表面所含的微生物不僅種類多,而且數(shù)量大,大白菜外葉含微生物約13×108/g ,根菜類表面所含的數(shù)量更大,但有益菌一般數(shù)量都較低

7、【10】。</p><p><b>　　2.1 乳酸菌</b></p><p>　　乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌,以產(chǎn)生乳酸作為發(fā)酵代謝中主要或唯一代謝產(chǎn)物特征的細(xì)菌。它屬于兼性厭氧菌。在自然界分布廣,種類多[11]。在蔬菜腌制發(fā)酵中的乳酸菌分別屬于糞鏈菌屬、明串球菌屬、片球菌屬和乳桿菌屬。其中，在蔬菜初始發(fā)酵階段和主發(fā)酵階段起主要作用的乳酸菌主要為糞鏈球菌、腸膜明串珠菌

8、和短乳桿菌。</p><p>　　腸膜明串珠菌的快速生長降低了pH值,從而抑制了有害微生物的生長和軟化蔬菜酶的活性；產(chǎn)生的CO2替代了空氣,造成厭氧環(huán)境,不僅有利于穩(wěn)定蔬菜中的色澤,而且也有利于其它乳酸菌按一定的順序生長；產(chǎn)生的酸、醇等與其它產(chǎn)物結(jié)合起來,使產(chǎn)品具有特有的風(fēng)味；腸膜明串珠菌能把多余的糖轉(zhuǎn)化成甘露醇和葡聚糖,甘露醇和葡聚糖一般只能被乳酸菌利用,而不能被其它微生物利用,也不能與氨基酸結(jié)合成醛基或酮基,

9、因此不會引起食品的褐變。短乳酸菌能夠發(fā)酵戊糖,使產(chǎn)品具有獨(dú)特的風(fēng)味。</p><p><b>　　2.2 酵母菌</b></p><p>　　蔬菜腌制中酵母菌可以從蔬菜采摘后本身表面帶來,也有從腌制工具和空氣中自然落入而來。蔬菜腌制中常見的酵母主要是啤酒酵母、產(chǎn)醭酵母和魯氏酵母等。</p><p>　　酵母發(fā)酵所生成的乙醇對腌制品在后熟階段發(fā)生

10、酯化反應(yīng)和生成芳香物質(zhì)是很重要的。其它醇類的產(chǎn)生對風(fēng)味也有一定的影響。酵母菌產(chǎn)生的乙醇也作為醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵的基質(zhì)。</p><p><b>　　3 分子檢測技術(shù)</b></p><p>　　對環(huán)境中微生物種群的類型和數(shù)量進(jìn)行及時和準(zhǔn)確的分析測定在微生物生態(tài)研究中十分重要, 傳統(tǒng)的微生物分析測定方法, 在環(huán)境樣品研究中都存在一定的缺陷。近年來, 一些分子生物學(xué)技術(shù)的

11、聯(lián)合應(yīng)用[12]，使我們不僅可以定性，還可定量研究微生物菌落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化，深入探索微生物菌落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程。</p><p>　　3.1 16S rDNA技術(shù)原理</p><p>　　細(xì)菌含有3種不同的RNA，即mRNA、tRNA和rRNA。其中rRNA是蛋白質(zhì)合成必需的，所以它們廣泛存在于所有的原核生物中，并且結(jié)構(gòu)和功能都是保守的；16S rDNA的序列中

12、包括可變區(qū)和高變區(qū)，因此既可以利用保守區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，又可以利用高變區(qū)來進(jìn)行序列間的比對它們的序列變化比較緩慢而且在原核生物中不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，因此16S rDNA 之間序列的差異可以反映不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系。</p><p>　　從上世紀(jì)70年代以來,科學(xué)家們因16S rRNA的保守性, 對其進(jìn)行了大量研究工作,現(xiàn)在已對16S rDNA序列有了清晰的認(rèn)識。在細(xì)菌的16S rDNA中有多個區(qū)段高度保守[13],

13、根據(jù)這些保守區(qū)人們可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌的通用引物, 可以用來擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16S rDNA片段, 并且這些引物僅對細(xì)菌是特異的, 也就是說這些引物不會與非細(xì)菌的DNA互補(bǔ), 而細(xì)菌的16S rDNA可變區(qū)的差異則可以用來區(qū)分不同的菌。因此, 16S rDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子[14]。</p><p>　　3.2 16S rDNA技術(shù)基本研究方法</p><p>

14、　　根據(jù)以上原理，我們從環(huán)境微生物樣品中提取出rRNA或總DNA后，就可以利用PCR擴(kuò)增、核酸雜交、梯度電泳和DNA測序等技術(shù)分析微生物樣品的16S rDNA，從而對環(huán)境微生物進(jìn)行檢測，或?qū)ζ溥M(jìn)行分類、定位[15]。</p><p>　　無論是全長還是部分16S rDNA/rRNA 序列, 都可以提交到國際互聯(lián)網(wǎng)GeneBank, 采用BLAST和RDP(Ribosomal Database Project Pr

15、ograms)與已知序列進(jìn)行相似性分析, 然后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。</p><p>　　3.3 16S rDNA在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用</p><p>　　白潔[16]等人采集黃海西北部海域春秋2個季節(jié)的沉積物樣本,采用微生物分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建細(xì)菌16S rDNA文庫,并進(jìn)行序列測定和多樣性指數(shù)分析,探討細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和分布特征,研究鄰界水域、人類活動以及黃海冷水團(tuán)等自然和人為因素對黃海西北

16、部微生物種類組成、數(shù)量、優(yōu)勢菌群等的影響,以及功能微生物對環(huán)境因子的響應(yīng),有助于深層次理解該海域沉積物的生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能,為我國近海微生物資源及生態(tài)環(huán)境的研究提供理論依據(jù)。</p><p>　　在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用l6S rDNA分析方法能使研究者更深入地洞察養(yǎng)殖水生環(huán)境的細(xì)菌多樣性[17]，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。16S rDNA技術(shù)也開始應(yīng)用于水環(huán)境細(xì)菌群落和魚類消化道細(xì)菌群落的調(diào)查，如李志崗[

17、18]等利用l6S rDNA限制性片斷長度多態(tài)性分析了水環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。</p><p>　　目前, 16S rDNA序列分析方法在乳酸菌分類鑒定運(yùn)用比較多, 用PCR產(chǎn)物建立16S rRNA基因克隆庫通過16S rDNA序列分析確定身份。并與有關(guān)的16S rRNA數(shù)據(jù)庫比較建立分類學(xué)上的關(guān)系[19]。Choi[20]利用16S rDNA序列分析和DNA雜交技術(shù)研究了泡菜中乳酸菌的菌群變化, 在泡菜5d的發(fā)酵過

18、程中隨機(jī)分離出120株乳酸菌, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的前中期, 檸檬明串珠菌(L.citreum)是優(yōu)勢種, 然而在發(fā)酵后期主要為清酒乳桿菌(L.sake)或彎曲乳桿菌(L.curvatus)以及短乳桿菌。烏日娜[7]等采用16S rDNA測序和同源性分析的方法, 以大于98%的同源性將L.casei.zhang和ZL12-1分別鑒定為 L.casei subsp.casei和L. gallinarum。燕平梅[21]等利用16S rDNA基

19、因序列方法分析傳統(tǒng)發(fā)酵菜中乳酸菌的多樣性，得出4種獨(dú)特的菌落，并且利用這種分子方法發(fā)現(xiàn)了常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)未鑒定的乳酸菌。</p><p>　　構(gòu)建克隆文庫是微生物分子生態(tài)學(xué)中用來研究微生物組成的常用方法之一,目前細(xì)菌菌群分析中應(yīng)用最多的是16S rDNA克隆文庫方法[22]。它是通過對16S rDNA全長序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析,達(dá)到研究和監(jiān)測樣品與環(huán)境中細(xì)菌多樣性、種群結(jié)構(gòu)和區(qū)系變化的目的,并應(yīng)用于水體、土壤、海洋沉

20、積物、生物水處理系統(tǒng)中的微生物分析[23]。通過建立16S rDNA克隆文庫的方法,通過測序并與已知序列比較確定細(xì)菌種類,以揭示有機(jī)物料腐熟菌劑樣品中的細(xì)菌組成,同時也可以根據(jù)克隆文庫中克隆子出現(xiàn)的頻率了解樣品的細(xì)菌組成比例[24]。</p><p>　　近年來T Yamamoto等設(shè)計(jì)和合成出人腸道區(qū)系中常見的雙歧桿菌屬5個種(兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長雙歧桿菌)的特異性的寡核苷酸

21、探針, 它們具有16-19個堿基長度, 并與這5個種的16S rRNA序列互補(bǔ)[25]。用天然高分子量的RNA制備物作為靶子,這些寡核苷酸探針對于人腸道中這些種的菌株具有高度的種特異性, 結(jié)果表明用此法檢測這5個種的16S rRNA序列能取得所期望的結(jié)果, 并且整個試驗(yàn)過程從獲得純細(xì)胞物后只需6h可完成。</p><p>　　4 存在的問題和展望</p><p>　　傳統(tǒng)的表型、生物化學(xué)方

22、法鑒定微生物耗時耗力,而且培養(yǎng)條件的改變可能會導(dǎo)致結(jié)果發(fā)生變化,鑒定結(jié)果很不穩(wěn)定,其結(jié)果也仍是表觀的, 很難反映生物的遺傳本質(zhì)。隨著分子生物學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展, 分子標(biāo)記技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段。盡管如此,目前還沒有一種分子標(biāo)記技術(shù)能單獨(dú)勝任對微生物的鑒定, 只有同其他方法結(jié)合起來進(jìn)行比較研究,尤其是傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法結(jié)合起來對微生物的分類鑒定才會得到比較滿意的結(jié)果。由于16SrRNA 序列的

23、保守性和存在的普遍性, 以及核酸序列本身的穩(wěn)定性、序列分析的重現(xiàn)性極高, 基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn), 應(yīng)用16SrRNA作為分子指標(biāo), 可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡便的對微生物進(jìn)行分類鑒定。分子分類正是在從研究的目的過渡到研究的手段。隨著分子分類的理論和方法的日趨成熟, 其已逐步成為微生物資源調(diào)查和整理的一種強(qiáng)有力工具。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><

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