四膜蟲在毒理學(xué)中的研究【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù) </b></p><p>　　四膜蟲在毒理學(xué)中的研究</p><p>　　摘要：四膜蟲(Tetrahymena)是毒理學(xué)研究的良好模式生物，本文回顧并總結(jié)了以四膜蟲為生物模型的毒理學(xué)研究，對通過進(jìn)行各種環(huán)境化學(xué)毒物脅迫下四膜蟲的群

2、體生長動力，形態(tài)結(jié)構(gòu)，酶的活性、DNA的損傷以及基因的表達(dá)等特性的變化來研究毒物毒性進(jìn)行了綜述。</p><p>　　關(guān)鍵詞：四膜蟲；毒性評價；QSAR；DNA損傷</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　四膜蟲(Tetrahymena)是原生生物門(Protista)纖毛蟲綱(Ciliophora)的一種單細(xì)胞真核生物，

3、主要分布于淡水水域中。其顯著特點是具有核雙型現(xiàn)象(Nuclear dimorphism)[1]。然而一直以來四膜蟲的社會認(rèn)知度和關(guān)注度卻遠(yuǎn)不如其他真核模式生物。事實上它離我們并不遙遠(yuǎn)，只是因為它如針尖大小，不被我們注意。四膜蟲為生命科學(xué)的研究作出了巨大的貢獻(xiàn)。1989年切赫教授就是因在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)核酶而獲得當(dāng)年化學(xué)獎，而伊莉莎白·布萊克本(Elizabeth H. Blackburn)、卡羅爾· 格雷德(Carol

4、W. Greider)、杰克· 紹斯塔克(Jack W. Szostak)三位美國科學(xué)家能夠在端粒和端粒酶保護(hù)染色體機理的研究領(lǐng)域取得巨大成就，并獲得2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，與四膜蟲也是息息相關(guān)的。此外，作為先進(jìn)的分子遺傳學(xué)工具，四膜蟲已建立起一系列成熟的基因重組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子遺傳學(xué)操作方法和技術(shù)，使得在嗜熱四膜蟲中進(jìn)行基因敲除和插入、基因表達(dá)抑制和基因過表達(dá)等十分方便快捷。</p><p>

5、　　四膜蟲在自然界中分布廣泛，在水域食物鏈系統(tǒng)中處于能量流動與物質(zhì)循環(huán)的一個基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，直接暴露在水體中，對有毒物質(zhì)反應(yīng)敏感。其個體小、繁殖周期短，是第一種進(jìn)行實驗室無菌純培養(yǎng)并實現(xiàn)細(xì)胞同步化的纖毛蟲，再加上其在分子遺傳學(xué)以及一些基礎(chǔ)研究中的成就，它越來越受到毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)家的關(guān)注，并越來越多的被運用到相關(guān)領(lǐng)域的研究當(dāng)中[2, 3, 4]。迄今為止，科學(xué)家已對四膜蟲的諸多物種進(jìn)行了多方面研究，本文概括總結(jié)了研究化學(xué)物質(zhì)對四膜蟲毒性的主

6、要方法和內(nèi)容。</p><p><b>　　研究方法與內(nèi)容</b></p><p>　　2.1　群體生長動力研究</p><p>　　在適宜條件下四膜蟲生長符合典型的微生物生長曲線模型，當(dāng)外源性有毒物質(zhì)存在時，種群傳代情況發(fā)生改變，據(jù)此可通過分析四膜蟲的動態(tài)生長曲線來指示其對所處生長環(huán)境中有毒物質(zhì)的反應(yīng)情況。目前普遍采用在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行密

7、度計數(shù)以及流式細(xì)胞儀計數(shù)。黃衛(wèi)紅等通過以嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila BF5 )為靶生物，在PPYS培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基中研究了生長穩(wěn)定期中的四膜蟲暴露于50μg·L-1、250μg·L-1和l000μg·L-1六氯苯的中短期生物毒性，得出在培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)的存在可降低及緩解六氯苯對四膜蟲的生物毒性的結(jié)論[5]。在姚瑩等進(jìn)行的納米ZnO對嗜熱四膜蟲的生態(tài)毒性研究中，用該法得出

8、低濃度ZnO對嗜熱四膜蟲的增殖具有促進(jìn)作用，其中l(wèi)00mg·L-1處理組促進(jìn)作用最明顯[6]。王永興等應(yīng)用該方法通過實驗驗證了刺泡發(fā)射實驗方法的可行性，說明該試驗是一種值得推薦的快速、簡便、可靠的水生生物短期測試法[7]。</p><p>　　2.2　形態(tài)結(jié)構(gòu)研究</p><p>　　許多研究人員在計數(shù)實驗之外還結(jié)合了超微結(jié)構(gòu)分析研究，提供了形態(tài)變化、毒性物質(zhì)作用部位以及生理變化

9、的相關(guān)數(shù)據(jù)。如張蔚霞等在鐵系納米材料對四膜蟲的安全效應(yīng)試驗中在偏光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)不同程度呈現(xiàn)了黑色顆粒物，而且納米磁性Fe3O4組和磁性鐵氧化物及納米沸石分子篩組裝體組在四膜蟲細(xì)胞體內(nèi)出現(xiàn)了較多團聚體[8]。另外，Nilsson在關(guān)于鋅離子濃度對四膜蟲的毒性作用的實驗中，利用電鏡照片準(zhǔn)確地顯示了鋅離子濃度梯度下四膜蟲胞質(zhì)內(nèi)小型折射顆粒的數(shù)目、結(jié)合位點及與食物泡相融合等一系列結(jié)果[9]。Mountassif的實驗中顯示鎘、鐵、鋁鹽對

10、梨形四膜蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)有所影響[10]。</p><p>　　2.3　細(xì)胞內(nèi)大分子水平及酶活性研究</p><p>　　關(guān)于化學(xué)脅迫下四膜蟲的生理生化特性的改變包括胞內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成及代謝被不同程度地抑制或激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子水平的改變[11, 12]。因此四膜蟲體內(nèi)代謝產(chǎn)物和指標(biāo)的變化可以作為毒性效應(yīng)指示的特殊標(biāo)志。在諸如此類的實驗當(dāng)中，已有生物大分子與關(guān)

11、鍵代謝酶及抗氧化系統(tǒng)、ATP含量、胞內(nèi)pH值、氧氣攝取量以及呼吸代謝反應(yīng)的變化等作為生化標(biāo)記物用于檢測不同化學(xué)物質(zhì)的毒性。同時，對更多有效生化指標(biāo)的探索也在不斷開展，已有一些特殊的蛋白（如鈣調(diào)素、熱激蛋白）與酶（琥珀酸脫氫酶[13]、超氧化物歧化酶[6]）活性在以四膜蟲為材料的試驗中被報道[14]。</p><p>　　2.4　DNA的損傷的檢測</p><p>　　2.4.1　單細(xì)胞凝膠

12、電泳檢測DNA損傷</p><p>　　單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)又稱彗星實驗(comet assay)，是由Ostling等在1984年提出，之后經(jīng)Singh等進(jìn)一步完善的一種敏感、經(jīng)濟、快速的檢測單個細(xì)胞原發(fā)性DNA損傷的技術(shù)，通過檢測核DNA 斷片的析出量（彗尾長度、拖尾率）顯示核DNA損傷和細(xì)胞受損傷程度，其特點是可直接觀察單個細(xì)胞內(nèi)的DNA

13、損害[15, 26]。該方法廣泛用于復(fù)合環(huán)境污染、DNA損傷與修復(fù)的檢測、遺傳毒理學(xué)、細(xì)胞凋亡機制的研究[16]。通過統(tǒng)計細(xì)胞損傷率等分析判斷被測物的毒性。</p><p>　　在徐忠東等采用SCGE研究不同濃度重金屬鎘離子對四膜蟲核DNA的損傷作用的研究中，結(jié)果顯示重金屬鎘離子對四膜蟲核DNA損傷具有明顯的濃度效應(yīng)[16]。谷康定等則從實驗中得出四膜蟲SCGE從方法上完全可以與動物原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞互相替代的結(jié)

14、論，但四膜蟲單細(xì)胞凝膠電泳實驗是后二者所不及的[15]。王麗等認(rèn)為四膜蟲作為生物材料應(yīng)用于單細(xì)胞凝膠電泳實驗，在遺傳毒性檢測、環(huán)境水質(zhì)檢測等方面具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢和廣闊發(fā)展前景[17]。</p><p>　　2.4.2　流式細(xì)胞儀</p><p>　　流式細(xì)胞術(shù)是利用熒光技術(shù)來檢測DNA小片段，從而了解單細(xì)胞及其DNA的受損情況。此方法能夠快速高效地檢測單細(xì)胞的表型、細(xì)胞增殖、胞內(nèi)蛋白及凋

15、亡等，還可以定量檢測DNA含量，在細(xì)胞生物學(xué)等研究中應(yīng)用廣泛[18, 19]。</p><p>　　徐忠東等采用SCGE和流式細(xì)胞術(shù)兩種快速而靈敏的檢測方法聯(lián)合檢測，以四膜蟲的細(xì)胞損傷率、彗尾長度、DNA 損傷專用單位、拖尾率以及DNA 相對熒光強度為指標(biāo)，研究異喹啉、喹啉、吲哚、吡啶四種含氮雜環(huán)化合物引起四膜蟲核DNA損傷而表現(xiàn)的毒性作用，結(jié)果顯示四種化合物均表現(xiàn)出較強的毒性，毒性由強到弱依次為異喹啉、喹啉、吲

16、哚、吡啶[18]。另外，他們應(yīng)用相同技術(shù)進(jìn)行了模擬葉綠素等合成的化合物四氮雜大環(huán)Zn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)兩種配合物在不同濃度條件下對四膜蟲核DNA損傷作用，結(jié)果顯示兩種配合物均表現(xiàn)出一定毒性，四氮雜大環(huán)Co(Ⅱ)配合物的毒性大于四氮雜大環(huán)Zn(Ⅱ)配合物的毒性[19]。此外，流式細(xì)胞計數(shù)儀也可用作數(shù)目統(tǒng)計實驗，結(jié)果以半抑制濃度(IC50-values)表示。所得結(jié)果被認(rèn)為與傳統(tǒng)計數(shù)法基本等價，但是后一種方法對所測試的毒性底物種類有更多限制

17、，也更易受人為干擾。目前，已發(fā)展雙色熒光染料標(biāo)記的方法，其靈敏度和精確性更高。</p><p>　　2.5　利用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)評估毒性</p><p>　　對工業(yè)生產(chǎn)中成千上萬種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行逐一的毒性評估是非常困難的，僅靠實驗無法有效地估計有毒化合物對四膜蟲的生長影響。近年來Schultz研究小組以四膜蟲為生物模型，利用定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structurea

18、ctivity　relationship，QSAR)方法通過已知的化學(xué)物質(zhì)毒性來預(yù)測其他化學(xué)品的潛在毒性，并建立了一系列化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，這才從某種程度上克服了這一難題[24]。一些QSAR方法，如CoMFA、亞結(jié)構(gòu)分析方法、Hansh分析方法和EVA等，已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[21]。劉紅艷等采用比較分子力場分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)描述子表征了133種苯酚類化合物對

19、梨形四膜蟲的毒性，從133個化合物中隨機選取113個作為訓(xùn)練集建立CoMFA模型，揭示這些化合物對梨形四膜蟲毒性的立體結(jié)構(gòu)和電荷分布的量變規(guī)律，為預(yù)報化合物對梨形四膜蟲的潛在毒性提供線索[22]。陳達(dá)等采用全息定量結(jié)構(gòu)活性相關(guān)分析(Holographic QSAR或HQSAR)分析了30個酯類化合物對四膜蟲的毒性與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系</p><p>　　2.6　基因表達(dá)特性</p><p>

20、;　　從分子水平探討和研究重金屬在生物體內(nèi)的相互作用機制及生物體的響應(yīng)機制，不僅為認(rèn)識和解決重金屬的污染問題和毒性機理奠定基礎(chǔ)，同時也是當(dāng)前毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)發(fā)展的特點和趨勢之一。目前，需要解決的關(guān)鍵問題是：選擇更為敏感和優(yōu)良的模式物種、選擇更有效和有針對性的分子標(biāo)記及選擇高靈敏度的基因表達(dá)實驗方法。俞婷等在熒光定量PCR優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用該技術(shù)考察了不同濃度的重金屬鎘和銅對嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白基因(MTT1)誘導(dǎo)表達(dá)的變化規(guī)律，結(jié)果表

21、明：鎘離子對MTT1基因表達(dá)的誘導(dǎo)更靈敏，鎘與銅同時誘導(dǎo)時MTT1基因的表達(dá)情況與鎘單獨誘導(dǎo)的類似，但閾值濃度減小，表明二者的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用[23]。</p><p><b>　　3　展望</b></p><p>　　隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，環(huán)境污染問題也更加嚴(yán)峻，加大對環(huán)境保護(hù)的投入，提高環(huán)境保護(hù)意識，加強環(huán)境監(jiān)測尤為重要。在環(huán)境毒理學(xué)的研究中，四膜蟲作為一種被廣泛

22、運用的生物模型，其多種多樣的毒性反應(yīng)從不同角度和層次給我們提供了許多有價值的毒理學(xué)信息[25]。盡管四膜蟲對有毒物質(zhì)的毒性反應(yīng)往往因?qū)嶒灄l件的不同而有所差異，而且還有許多機理問題尚未搞清楚，但是相信隨著研究的不斷深入，四膜蟲這一生物模型在環(huán)境毒理學(xué)研究中將顯示出它更大的優(yōu)勢。此外，還應(yīng)充分認(rèn)識原生動物在生態(tài)系統(tǒng)中的重要性，不斷改進(jìn)和完善原生動物監(jiān)測研究方法，特別是改進(jìn)細(xì)胞水平毒性試驗的研究，與理化檢測相互補充、修正，對試驗參數(shù)應(yīng)用數(shù)學(xué)分

23、析和計算機處理建立數(shù)學(xué)模型，以充分發(fā)揮原生動物在環(huán)境監(jiān)測中的作用。為毒理學(xué)研究、合理利用自然資源、評價生態(tài)環(huán)境質(zhì)量、恢復(fù)重建生態(tài)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等工作提供依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　楊超, 邸偉, 張飛雄. 伊麗莎白·布萊克本與端粒和端粒酶研究[J]. 遺傳(北京), 2010, 32 (1): 1-3. <

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