轉(zhuǎn)galE基因煙草的耐旱性分析及其可能機理的探討.pdf

1、據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界的陸地面積中約有三分之一是干旱、半干旱土地，且該比例有逐年上升的趨勢。干旱對全球農(nóng)作物產(chǎn)量的影響在諸多自然逆境中居首位，其危害相當(dāng)于其它自然災(zāi)害之和。因此，植物耐旱機理相關(guān)研究及探索如何提高植物抗旱能力長久以來都是科學(xué)家關(guān)注的熱點之一。從分子水平上闡明植物抗旱性的物質(zhì)基礎(chǔ)及其生理功能，從而通過基因工程方法創(chuàng)造耐旱新品種是植物抗旱性研究的一個重要領(lǐng)域。
　　 干旱脅迫對植物的影響廣泛而深刻，可以影響到從種子萌發(fā)

2、、營養(yǎng)生長和生殖生長，一直到開花結(jié)實；同時干旱還能影響到植物的諸多生理代謝過程，如光合作用、呼吸代謝、水分和營養(yǎng)元素的吸收轉(zhuǎn)運、各種酶的活性和有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、運輸和積累等。植物抗逆生理上的適應(yīng)主要有生物膜結(jié)構(gòu)與功能的適應(yīng)、滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)、抗氧化作用等等，而在分子水平則誘導(dǎo)了耐旱相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 目前已知的，可以增強植物耐旱性的糖類物質(zhì)主要是一些可溶性糖類，包括海藻糖、蔗糖、棉子糖系列寡糖及糖蛋白等，其抗旱作用機理主要是參與滲

3、透調(diào)節(jié)、保護(hù)生物膜系統(tǒng)、清除氧自由基以及通過參與抗旱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)等。
　　 GalE基因來源于大腸桿菌，該基因編碼UDP-galactose-4-epimerase(EC5.1.3.2)，該酶在正常的代謝途徑中催化由UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆轉(zhuǎn)換。本工作以轉(zhuǎn)galE基因T3代煙草作為研究材料，包括轉(zhuǎn)正義基因和轉(zhuǎn)反義基因株系，探討了galE基因在提高煙草耐旱性方面的作用及其可能的作用機理。PCR及RT

4、-PCR實驗結(jié)果表明，galE基因穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因煙草中，并活躍表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因煙草在種子萌發(fā)階段和幼苗期分別進(jìn)行干旱脅迫處理，測定其抗旱相關(guān)的生理生化指標(biāo)及該基因的表達(dá)變化，得到的主要實驗結(jié)果如下：
　　 在含有相同濃度甘露醇的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)正義基因的煙草植株的種子萌發(fā)率高于轉(zhuǎn)反義基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。幼苗?00 mM和250 mM甘露醇的脅迫條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)正義基因株系的小苗可表現(xiàn)出比較明顯的生長優(yōu)勢，并在根長和生物量方面

5、都要顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)反義基因及對照株系小苗，表明轉(zhuǎn)基因煙草中g(shù)alE基因的表達(dá)提高了煙草種子萌發(fā)階段及苗期的耐旱性。
　　 對9-11葉期的煙草植株進(jìn)行干旱脅迫處理，分別于處理前、輕度萎蔫、重度萎蔫和恢復(fù)澆水后取材，分析目的基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的變化情況，并測定光合作用相關(guān)參數(shù)、膜損傷參數(shù)、抗氧化保護(hù)酶系等生理指標(biāo)。對galE基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物活性進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果表明，干旱處理后galE基因表達(dá)活性隨著萎蔫程度的加強而增強，且表達(dá)產(chǎn)

6、物也表現(xiàn)出同樣的趨勢，表明該基因的表達(dá)與耐早性緊密關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步對脅迫前后植株進(jìn)行光合系統(tǒng)參數(shù)分析，在光系統(tǒng)Ⅱ沒有受損的情況下，正義株系L54在氣孔導(dǎo)度、胞間C02濃度及蒸騰作用等方面的指標(biāo)都顯著優(yōu)于反義株系L23及對照株系WT,同時葉綠素含量也不斷下降，光合速率和葉綠素含量導(dǎo)致光合功能衰退過程中，碳同化效率和光能轉(zhuǎn)化效率失衡，使多余電子傳遞給氧而形成活性氧：比較三個株系的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)中SOD和POD的活性，結(jié)果表明，株系L54的兩個

7、酶活性都有比較顯著的優(yōu)勢，在主要的抗氧化保護(hù)酶SOD活性方面優(yōu)勢尤其明顯，說明該基因在干旱脅迫條件下對煙草的抗氧化保護(hù)起到積極的作用；進(jìn)一步的膜損傷測定結(jié)果表明，株系L54的離子滲漏要顯著小于株系L23及WT的，產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物丙二醛也顯著少于株系L23及WT的；在干旱脅迫下，植株脯氨酸含量有很大幅度的升高，株系L54的脯氨酸含量與未處理相比提高10.70倍。綜合滲透勢的變化及糖分含量的測定結(jié)果，可以確定L54株系在受到干旱脅迫后，通過

8、維持細(xì)胞滲透勢來抵抗干旱的能力要顯著強于L23及WT株系。
　　 通過以上對干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)及生理生化指標(biāo)的分析可知，gal基因的正義表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱能力，推測其可能的作用機理是： galE酶催化生成的產(chǎn)物參與到滲透保護(hù)物質(zhì)蔗糖的生物合成中；蔗糖進(jìn)一步參與到半乳糖肌醇及棉子糖的合成過程中，半乳糖肌醇和棉子糖一方面可作為滲透調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，另一方面可能起到保護(hù)植物細(xì)胞免受非生物脅迫引起的過氧化物分子