葡萄SSR反應(yīng)體系的建立及遺傳多樣性分析.pdf

1、葡萄是非常古老的經(jīng)濟(jì)果樹之一，栽培歷史悠久，分布地域廣泛，品種資源非常豐富。隨著近代農(nóng)業(yè)科學(xué)的迅速發(fā)展，栽培面積日趨擴(kuò)大，然而，栽培品種卻日趨狹窄，對(duì)葡萄的遺傳特性的了解由于葡萄高度雜合、近交抑制、相對(duì)較長(zhǎng)的幼年期等，其系統(tǒng)研究尚顯不足。上世紀(jì)50年代末，才開始加強(qiáng)葡萄的遺傳學(xué)研究。近年由于分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已在葡萄遺傳學(xué)研究方面取得了顯著成果。本研究在建立和優(yōu)化葡萄SSR.反應(yīng)分析體系的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)39份葡

2、萄品種的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，在分子水平上葡萄種質(zhì)資源鑒定和品種親緣關(guān)系分析提供依據(jù)，對(duì)SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于葡萄品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 主要研究結(jié)果如下: (1)在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上，將分別加入酚的結(jié)合劑(PVP20％)和抗氧化劑(β-巰基乙醇)兩類方法組合起來(lái)有效去除多酚類雜質(zhì)，這種改良的CTAB法試用于葡萄基因組DNA的提取，制備的DNA無(wú)凝膠狀物質(zhì)、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)，適于PCR擴(kuò)增。

3、 (2)確定了適合葡萄SSR反應(yīng)的體系為:模板DNA為20～30ng，Md2+1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶IU，Primer0.5umol/L,總體積為20ul，剩下的用ddH2O來(lái)補(bǔ)充；確定了適合葡萄SSR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性4min，95℃變性50s，50～60℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。 (3)從22對(duì)引物中篩選出能穩(wěn)定擴(kuò)增的1

4、2對(duì)引物，用12對(duì)SSR引物比較了39個(gè)葡萄品種的遺傳多樣性。結(jié)果表明，12對(duì)引物在上述品種中共擴(kuò)增出155條DNA譜帶，其中多態(tài)性帶有149條，占擴(kuò)增總帶數(shù)的96.13％，特異性條帶8條，占5％，所擴(kuò)增的片段大小在50～1000bp之間，不同引物擴(kuò)增的帶數(shù)在5～24之間，平均12.9條，其中擴(kuò)增條帶最多的是引物VrZAG67，擴(kuò)增出24條帶；最少的是VrZAG47，僅擴(kuò)增了5條帶。 (4)對(duì)葡萄屬39個(gè)品種及類型進(jìn)行了SSR擴(kuò)

5、增，應(yīng)用NTSYS軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算，品種間遺傳相似系數(shù)變異在0.368～1.00之間，利用UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖，在相似系數(shù)為0.660的閾值下，可將39份材料分為3大類群:第1類包括格拉卡和美人指兩個(gè)品種；第2類包括玫瑰香、紅旗特早、達(dá)米娜、玫瑰玉、紅玫瑰等；第3類包括京云、奧古斯特、無(wú)核早紅、巨峰等。 (5)建立了巨峰、高路比、格拉卡等品種的DNA指紋圖譜，找到了它們的特異譜帶，利用不同的引物組合，根據(jù)DNA指紋