小葉錦雞兒SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性研究.pdf

1、小葉錦雞兒(Caragana microphylla Lam.)為豆科錦雞兒屬多年生飼用灌木，多分布于中國東北及內蒙古、河北、山西，陜西，山東等地；蒙古、西伯利亞也有分布。因其耐干旱、低溫、能抗風沙，再生力強，耐瘠薄等特性而成為我國東北、西北地區(qū)良好的飼用灌木和生態(tài)保護先鋒植物，具有極大的開發(fā)利用潛力。
　　 本研究所用材料為中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所種質資源研究室提供的10個內蒙古中東部野生小葉錦雞兒居群。利用ISSR-

2、PCR技術開發(fā)小葉錦雞兒SSR多態(tài)性引物，并利用所篩選引物進行小葉錦雞兒遺傳多樣性及遺傳結構研究。主要結果如下：
　　 1.選用四種ISSR引物(S1：(AG)10、S2：(AC)10、S3：(GA)10、S4：(CA)10)分別開發(fā)小葉錦雞兒SSR引物，分別得到引物30對、0對、9對、4對，其產率相應為13.16％；0.00％；11.11％；9.09％，總產率為11.17％。從所開發(fā)結果看，小葉錦雞兒基因組中含有大量的(AG)

3、n片段，而(AC)n片段則相對很少；本次開發(fā)引物效率較傳統(tǒng)方法高，但成本較大，需經(jīng)兩次測序和三次引物合成。
　　 2.為建立適宜小葉錦雞兒SSR-PCR的反應體系，利用正交試驗設計L16(45)，對模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的濃度進行五因素四水平優(yōu)化篩選，確立了最佳反應體系和擴增程序。即在25μL反應體系中包括：40ng模板DNA，3 mmol/LMg2+，300μmol/LdNTP，0.6μmo

4、l/L引物，1U Taq DNA聚合酶，1×Buffer。反應程序為：94℃10 min；94℃45s，65℃1min，72℃1 min，10個循環(huán)，每循環(huán)的復性溫度遞減1℃;94℃45 s，55℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。
　　 3.應用上述優(yōu)化體系對自行開發(fā)的SSR引物進行PCR篩選，共得到有效擴增引物37對，占總開發(fā)引物的86.05％，其中多態(tài)性引物21對，占有效擴增引物的56

5、.76％，占總開發(fā)引物的48.84％。其余引物有5對(11.63％)得到擴增，但沒有一致性，也與目的片段相差很大，最后有1對(2.32％)沒有擴增產物，其原因可能為設計引物時所選用的序列為基因突變的片段。
　　 4.從21對多態(tài)性引物中選了10對進行小葉錦雞兒遺傳多樣性研究，共檢測到等位基因175個，He值在0.602-0.859之間，具有高多態(tài)性；10個居群的Nei基因多樣性指數(shù)(H)變幅為0.683-0.830，平均為0.7