人rhd基因結(jié)構(gòu)研究及意義

1、<p>　　人RHD基因結(jié)構(gòu)研究及意義</p><p>　　者：周華友，蘭炯采，王曉珠，樊紅，孟慶寶，張印則，王從容 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 聚合酶鏈反應(yīng) </p><p>　　【Abstract】 AIM: To analyze structure of RHD gene, emphasizing on detecting promote

2、r of RHD gene, and to investigate mechanism of RHD expressing. METHODS: 60 samples of unrelated RhD(+) Hans, 98 samples of RhD(-) Hans and 2 samples of weak D were detected by PCRSSP with 3 pairs of primers. RESULTS: Pr

3、omoters of individuals with RhD (-) phenotype /RHD (-) genotype were absent, while promoters of the RhDnegative individuals carrying the partial or intact RHD gene were present. CONCLUSION: Deletio</p><p>　　

4、【Keywords】 RHD genes; promoter regions (genetics); polymerase chain reaction sequence analysis; DNA primers; phenotype; genotype </p><p>　　【摘要】 目的： 研究RHD基因結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)，探究RHD基因的表達(dá)機(jī)制. 方法： 采用PCRSSP方法，設(shè)計(jì)3對(duì)序列特異

5、性引物，對(duì)60例無(wú)血源關(guān)系RhD(+)漢族人樣本、98例無(wú)血源關(guān)系RhD(-)漢族人樣本和2例弱D 型漢族人樣本RHD基因啟動(dòng)子區(qū)約1000 bp范圍內(nèi)的4個(gè)RHD基因特異性多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè). 結(jié)果： RhD表型(-)/RHD基因型(-)個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)全缺失，表型RhD陰性基因型為部分缺失或不缺失型個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)都不缺失. 結(jié)論： RhD表型(-)/RHD基因型(-)個(gè)體符合RhD陰性的普遍機(jī)制，表型RhD陰性基因型為部分缺失或不缺失型個(gè)

6、體存在另一種RhD陰性機(jī)制. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 RHD基因；啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)）；聚合酶鏈反應(yīng)序列分析；DNA引物；表型；基因型 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　人類(lèi)Rh血型系統(tǒng)（Rh血型系統(tǒng)中基因以RH表示，抗原以Rh表示）是臨床最重要的血型系統(tǒng)之一，也是人類(lèi)29個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最復(fù)雜最富有

7、多態(tài)性的一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)抗原抗體不相容能引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血［1-3］. Rh血型抗原由位于1號(hào)染色體短臂1p34.3-1p36.1上兩個(gè)緊密連鎖高度同源的RHD和RHCE基因編碼，這兩個(gè)基因序列同源性高達(dá)96%～97%，都含有10個(gè)外顯子，RHD基因編碼RhD多肽，RHCE基因編碼RhC/c和RhE/e多肽. 在絕大多數(shù)高加索人種中，RhD陰性個(gè)體RHD基因全缺失，這代表了RhD陰性的普遍機(jī)制，對(duì)RH

8、基因的深入研究證明RhD陰性多態(tài)性存在豐富的種族背景差異，可能有多種RhD陰性機(jī)制存在［4-6］. 我們采用PCRSSP方法對(duì)RhD陰性樣本的RHD基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)，重點(diǎn)檢測(cè)了啟動(dòng)子區(qū)，探討了漢族人RHD基因的表達(dá)機(jī)制. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p>

9、<p>　　10份RHD+/RHD+型、10份RHD+/RHD-型和10份RHD-/RHD-型標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院免疫遺傳實(shí)驗(yàn)室提供. 60例無(wú)血源關(guān)系RhD(+)漢族人樣本由廣州市血液中心提供；98例無(wú)血源關(guān)系RhD(-)漢族人樣本和2例弱D 型漢族人樣本由秦皇島市中心血站、錦州市紅十字中心血站、深圳市人民醫(yī)院輸血科和廣東省人民醫(yī)院輸血科提供. Taq DNA聚合酶和DNA Marker由大連TAKARA

10、公司提供，德國(guó)Biometra T1型PCR擴(kuò)增儀和Biometra恒溫恒壓電泳儀，SYNGENE公司產(chǎn)Gene Genius 型凝膠成像系統(tǒng). </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1RhD表型檢測(cè)聚凝胺法檢測(cè)RhD表型，抗D試劑為美國(guó)Immuncor公司和Domining生物公司的單克隆和多克隆抗血清. 聚凝胺法RhD陰性

11、樣本用改良抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)確認(rèn). 改良抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)RhD陰性樣本用三氯甲烷/三氯乙烯做吸收放散試驗(yàn) ,以確定是否為Del型(Absorption/elution, Del型). </p><p>　　1.2.2基因組 DNA的制備使用美國(guó) G &amp; T公司基因組 DNA快速抽提試劑盒 ,采用鹽析法從供血者外周血分離獲得: 0.3 mL EDTA抗凝外周血加1 mL紅細(xì)胞裂解液 ,離心棄上清 ,沉

12、淀加入170 μL核裂解液及 4 μL SDS,劇烈振蕩 ,再加入 72 μL 5 mol/ L NaCl溶液 ,12 000 g離心 5 min,取上清加入 210 μL異丙醇沉淀 DNA,將 DNA溶于 50～100 μL TE溶液中,4℃保存待用. </p><p>　　1.2.3RHD基因結(jié)構(gòu)區(qū)PCRSSP法檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)： 12.5 μL PCR反應(yīng)體系組成： 50～200 ng基因組DNA，1

13、×Buffer(50 mmol/L KCl, pH 8.0的10 mmol/L TrisHCl)，1.5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs，檢測(cè)引物濃度0.2 μmol/L，以擴(kuò)增人生長(zhǎng)激素基因（HGH）一段434 bp產(chǎn)物作為內(nèi)對(duì)照，內(nèi)對(duì)照引物濃度0.08 μmol/L，8.335 nkat Taq DNA聚合酶. 循環(huán)參數(shù)： 95℃預(yù)變性5 min，然后30個(gè)循環(huán)：94℃ 30 s, 5

14、6℃ 30 s, 72℃ 30 s, 最后72℃延伸5 min，4℃保存. 電泳： 20 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 mg溴化乙錠 / L膠），10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，5～8 V/cm 電壓電泳30 min，凝膠成像. 引物序列見(jiàn)Tab 1.表1RHD基因啟動(dòng)子區(qū)PCRSSP方法所用引物序列（略） </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p

15、>　　10份RHD+/RHD+型標(biāo)準(zhǔn)DNA檢出上、下游Rhesus盒，無(wú)雜合Rhesus盒，即RHD基因雙基因型，10份RHD+/RHD-型標(biāo)準(zhǔn)DNA檢出上、下游Rhesus盒和雜合Rhesus盒，即RHD基因單基因型，10份RHD-/RHD-型標(biāo)準(zhǔn)DNA只檢出雜合Rhesus盒無(wú)上、下游Rhesus盒，即RHD基因全缺失型，以上結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品型別一致(Fig 1). </p><p>　　98例無(wú)血源關(guān)系

16、RhD(-)漢族人樣本中54例（55.1%）只檢出雜合Rhesus盒無(wú)上、下游Rhesus盒（RHD-/RHD-型），即RHD基因全缺失型，36例（36.7%）同時(shí)檢出上、下游和雜合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），即RHD基因單基因型，8例（8.2%）只檢出上、下游Rhesus盒無(wú)雜合Rhesus盒（RHD+/RHD+型），即RHD基因雙基因型. </p><p>　　在98例RhD陰性樣本中檢出16例D

17、el型，這16例Del型中10例（62.5%）同時(shí)檢出上、下游和雜合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），6例（37.5%）只檢出上、下游Rhesus盒無(wú)雜合Rhesus盒（RHD+/RHD+型）. </p><p>　　2例弱D型樣本均檢出RHD 基因的10個(gè)外顯子； 98例RhD陰性樣本中，54例（55.1%）RHD基因全缺失型樣本都沒(méi)有檢出任何RHD基因外顯子，36例（36.7%）RHD+/RHD-型，即

18、RHD基因單基因型中24例檢出RHD基因10個(gè)外顯子（非缺失型），12例為外顯子部分缺失型；8例（8.2%）RHD+/RHD+型，即RHD基因雙基因型中6例均檢出RHD 基因的10個(gè)外顯子，2例只檢出RHD基因的第1, 2和第10個(gè)外顯子（RHDCE(29)D2型,）；16例Del型均檢出RHD基因的10個(gè)外顯子(Fig 2). </p><p>　　10份RHD-/RHD-型標(biāo)準(zhǔn)DNA以及98例無(wú)血源關(guān)系RhD

19、(-)漢族人樣本中的54例（55.1%）RHD-/RHD-型樣本，即RHD基因全缺失型樣本用3對(duì)特異性引物擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子區(qū)都擴(kuò)增不出特異帶；60例無(wú)血源關(guān)系RhD(+)漢族人樣本用3對(duì)特異性引物擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子區(qū)均擴(kuò)增出3條特異帶(256, 221和123 bp)，10份RHD+/RHD-型標(biāo)準(zhǔn)DNA和98例RhD陰性樣本中36例（36.7%）RHD+/RHD-型，即RHD基因單基因型樣本用3對(duì)特異性引物擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子區(qū)

20、均擴(kuò)增出3條特異帶；10份RHD+/RHD+型標(biāo)準(zhǔn)DNA和98例RhD陰性樣本中8例（8.2%）RHD+/RHD+型，即RHD基因雙基因型樣本用3對(duì)特異性引物擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子區(qū)均擴(kuò)增出3條特異帶；2例弱D型樣本和16例Del型樣本用3對(duì)特異性引物擴(kuò)增RHD基因啟動(dòng)子區(qū)均擴(kuò)增出3條特異帶(Fig 3). </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>

21、;　　RHD和RHCE基因緊密連鎖串聯(lián)排列，用不同的DNA鏈作編碼鏈，所以方向相反，基因排列順序?yàn)镽HDCE，兩個(gè)基因相隔30 000 bp. 兩個(gè)基因之間還有1個(gè)SMP1基因，該基因方向同RHD基因. RH基因結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 4. </p><p>　　近年關(guān)于 DR的實(shí)驗(yàn)研究中，Joussen 等［6］發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在1 wk就出現(xiàn)了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和死亡；Yamashiro 等［7］發(fā)

22、現(xiàn)糖尿病大鼠在2 wk出現(xiàn)了視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)血小板微血栓的聚集和內(nèi)皮細(xì)胞的死亡；Park 等［15］發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在1 wk出現(xiàn)了視網(wǎng)膜水平細(xì)胞突觸后突起的變性，在4 wk出現(xiàn)了節(jié)細(xì)胞的壞死；Barber 等［8］發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在1 mo時(shí)視網(wǎng)膜平鋪片TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞的數(shù)量比正常鼠增加10倍以上. 這些研究把以前糖尿病模型的研究時(shí)間點(diǎn)［3-5］大大提前，為探索人類(lèi)糖尿病的早期預(yù)防和治療起了十分重要的提示作用. 這些病理變化的出現(xiàn)

23、預(yù)示著視網(wǎng)膜電生理功能不可避免地出現(xiàn)改變. Li 等［16］發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠最早在2 wk時(shí)ERG的振幅就比對(duì)照組減少，且糖尿病對(duì)ERG b波的影響大于對(duì)a波的影響. </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到糖尿病大鼠在早期階段出現(xiàn)了視覺(jué)電生理功能的改變，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜電圖的潛伏期變化顯著，潛伏期在2 wk以后比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，但始終未出現(xiàn)振幅的改變. 與Li 等［16］的實(shí)驗(yàn)相比，我們的實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn) ERG 潛伏

24、期有變化，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ERG 的振幅有變化，推測(cè)可能由于我們實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难侵狄筝^低，短期內(nèi)對(duì)視網(wǎng)膜代謝的損壞程度輕微，因而沒(méi)有檢測(cè)到ERG振幅發(fā)生變化. 但是，我們和Li等［16］的研究都支持糖尿病大鼠在早期確實(shí)發(fā)生了視覺(jué)電生理功能的改變，這些提示我們應(yīng)當(dāng)把ERG檢查作為監(jiān)測(cè)DR早期發(fā)展的有效指標(biāo). DR目前仍無(wú)特效藥物治療，臨床常用的定期眼底熒光血管造影也只能監(jiān)測(cè)DR晚期是否造成了大面積毛細(xì)血管閉塞，因此對(duì)DR的早期診斷和對(duì)癥治療以延緩

25、視覺(jué)功能的漸進(jìn)性損失顯得更為重要，糖尿病早期ERG潛伏期的延長(zhǎng)有可能成為監(jiān)測(cè)DR早期發(fā)展的指標(biāo). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ Frank RN. Diabetic retinopathy ［J］. N Engl J Med, 2004; 350(1): 48-58. </p><p>

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38、vations ［J］. Exp Eye Res, 2002; 74(5): 615-625.</p><p>　　在RHD和RHCE基因之間以及RHD上游分別有1個(gè)Rhesus盒（Rhesus box），大小約9000 bp，RHD基因上下游的Rhesus盒方向同RHD基因，上游Rhesus盒(RHD的5′端)約9142 bp，終止于距RHD起始密碼子4900 bp位置，下游Rhesus盒（RHD的3′端）約9

39、145 bp，始于RHD終止密碼子后104 bp位置，這兩個(gè)Rhesus盒序列同源性高達(dá)98.6%，在Rhesus盒的5701 bp和7163 bp之間有1個(gè)1463 bp的等同區(qū)（identity region）［7］. 在高加索人種中，絕大多數(shù)RHD基因的缺失是由RHD基因高度序列同源的上下游Rhesus盒觸發(fā)的不等交換（cross over）引起. 斷裂點(diǎn)區(qū)域位于上下游的等同區(qū)內(nèi)，斷裂融合產(chǎn)生1個(gè)雜合Rhesus盒(Hybrid

40、 box)，雜合Rhesus盒包含RHD基因上游Rhesus盒的5′端和下游Rhesus 盒的3′端，上下游間的RHD基因完全缺失［7］. 在兩個(gè)基因的5′端側(cè)翼序列存在紅系特異性調(diào)控序列，該序列中包含啟動(dòng)子序列，使RhD, RhC/c和RhE/e在紅系中定</p><p>　　現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的RhD陰性多態(tài)性種族背景差異主要有以下幾種： RHD基因全缺失（gross deletion），RHD基因部分缺失（pa

41、rtial deletion），RHD基因不缺失（nondeletion），RHDψ假基因和RHDCED雜合基因等［4-6］. 對(duì)表型為RhD陰性中國(guó)人RHD基因結(jié)構(gòu)初步研究表明： 弱D表型和Del型個(gè)體RHD基因結(jié)構(gòu)基本正常，表型為RhD陰性個(gè)體中50%～65%的個(gè)體RHD基因全缺失，15%～30%個(gè)體RHD基因部分缺失，10%～25%個(gè)體RHD基因不缺失，抗人球蛋白試驗(yàn)陰性個(gè)體中約30%的人擁有RHD基因，吸收放散試驗(yàn)陰性個(gè)體中約

42、10%的人攜帶RHD基因［9,10］，本研究結(jié)果與此相符. 這些研究結(jié)果表明，在表型為RhD陰性中國(guó)人有相當(dāng)一部分人擁有RHD基因但不表達(dá)或表達(dá)水平極低以至于用常規(guī)抗血清方法無(wú)法檢測(cè)到［11］. </p><p>　　啟動(dòng)子是在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1）及其5′上游近端的一組具有獨(dú)立功能的DNA序列，是決定RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起著極其重要的作用. 本研究中我們用PCRSSP方

43、法，設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，重點(diǎn)檢測(cè)RHD基因啟動(dòng)子區(qū)約1000 bp范圍內(nèi)的4個(gè)RHD基因特有的多態(tài)性位點(diǎn). 結(jié)果表明RhD表型(-)/RHD基因型(-)個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)全缺失，這部分個(gè)體符合RhD陰性的普遍機(jī)制，但表型為RhD陰性基因型為部分缺失或不缺失型個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)都不缺失，這提示在中國(guó)人中還有另外的RhD陰性機(jī)制存在. 有研究表明在表型為RhD陰性中國(guó)人中存在一定數(shù)量的RHDCED基因和點(diǎn)突變導(dǎo)致RHD基因ORF錯(cuò)位而不表達(dá)［9］，RH

44、CE基因和RHD基因間交換重組錯(cuò)誤或點(diǎn)突變是否代表了表型為RhD陰性基因型為部分缺失或不缺失型中國(guó)人的RHD基因的陰性機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ Daniels GL, Anstee DJ, Cartron JP, et al. ISBT working party on terminol

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