1、我們從開花30~45d的大豆"白農(nóng)6號(hào)"未成熟種子的cDNA中擴(kuò)增出PM2全長基因序列,它可編碼463個(gè)氨基酸的多肽.將該基因克隆至pET28a大腸桿菌表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Star獲得BL/PM2菌株.根據(jù)PM2蛋白的結(jié)構(gòu),我們還構(gòu)建了PM2蛋白系列缺失克隆,即BL/PM2A(第1-262氨基酸序列)、BL/PM2B(129-262氨基酸序列,由6個(gè)重復(fù)的22-mer氨基酸序列組成)和BL/PM2C菌株(268個(gè)氨基酸,
2、由12個(gè)重復(fù)的22-mer氨基酸序列組成).將構(gòu)建的缺失克隆接種至高鹽培養(yǎng)基上,檢驗(yàn)它們所表達(dá)的多肽是否具有耐鹽功能.結(jié)果表明,與對(duì)照BL/pET28菌株(含pET28a空載體)相比,表達(dá)PM2蛋白的BL/PM2菌株耐鹽性(700mM NaCl和700mM KCl)明顯提高,而對(duì)1100mM山梨糖引起的滲透脅迫未顯示出高的抗性.進(jìn)一步比較缺失克隆在高鹽培養(yǎng)基上的存活率,證明在700mM NaCl和700mM KCl脅迫條件下,BL/PM
3、2菌株的存活率高出對(duì)照BL/pET28菌株的1~2倍;缺失克隆BL/PM2A和BL/PM2B菌株的存活率與BL/PM2菌株接近;而BL/PM2C菌株的存活率為BL/PM2菌株和BL/PM2B菌株的2~3倍.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PM2蛋白和22-mer可提高大腸桿菌的耐鹽功能,而且22-mer氨基酸序列表現(xiàn)出耐鹽結(jié)構(gòu)域的功能.為進(jìn)一步研究PM2、PM2A、PM2B和PM2C基因表達(dá)的多肽是否在高等植物中具有耐鹽功能,我們將上述核苷酸序列克隆
