轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acdS基因生菜幼苗耐鹽性的提高.pdf

1、全球有近10％的耕地屬于鹽堿地，土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和限制農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素之一，嚴(yán)重影響耕地的有效利用，影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生菜（Lactuca）以其營養(yǎng)價(jià)值高,低熱量,可生食而成為人們所喜愛的重要蔬菜作物。生菜在栽培過程中經(jīng)常因?yàn)楦珊怠Ⅺ}漬、高溫的影響，導(dǎo)致品質(zhì)和產(chǎn)量下降。利用基因工程進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良成為提高作物耐鹽性的一個(gè)快速有效的方法，建立穩(wěn)定高效的生菜轉(zhuǎn)化體系，培育耐鹽生菜新品種，為鹽堿地的生菜及作物種植提供技

2、術(shù)支撐和理論依據(jù)。
　　ACC脫氨酶可以將乙烯的合成前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸）水解成氨和α-酮丁酸，從而減少植物中產(chǎn)生的乙烯量，以提高植物抗性。論文克隆了蠟樣芽孢桿菌(HK)編碼 ACC脫氨酶的 acdS基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體35S::acdS-GFP，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化香港玻璃生菜。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了香港玻璃生菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。先將生菜葉片在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d，其中分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NA

3、A0.1mg/L，然后在OD600為0.6的農(nóng)桿菌菌液中浸泡8min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)3d，移入分化篩選培養(yǎng)基，篩選抗生素選擇 Hyg10mg/L，抑菌抗生素選擇 Cef300mg/L，選用1/2MS+0.05mg/L NAA+Hyg10mg/L作為生根培養(yǎng)基。
　　經(jīng)融合基因PCR分析和Western blot蛋白表達(dá)鑒定，融合基因成功整合到生菜基因組中，獲得了轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acdS基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因生菜幼苗株系，融合基因

4、定位在根系細(xì)胞的細(xì)胞膜上。外源acdS基因的導(dǎo)入使轉(zhuǎn)基因生菜表現(xiàn)出明顯的ACC脫氨酶活性。
　　轉(zhuǎn)基因生菜在鹽脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因生菜在鹽脅迫下的生長優(yōu)于野生型，在最高鹽處理時(shí)優(yōu)勢更明顯。轉(zhuǎn)基因生菜中脯氨酸含量在300mmol/LNaCl時(shí)達(dá)到802.02μg/g，是野生型的1.36倍；在300mmol/L NaCl時(shí)，轉(zhuǎn)基因生菜中可溶性糖含量為43033.80μg/g，是野生型的2.09倍，野生型植株為20533.80μg/

5、g；在NaCl300mmol/L時(shí)，野生型生菜SOD活性為不加鹽對(duì)照組的2.14倍，轉(zhuǎn)基因生菜SOD活性為不加鹽對(duì)照組的3.47倍，活性顯著高于野生型植株；在NaCl200mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因生菜中葉綠素含量為0.16mg/g，非轉(zhuǎn)基因生菜葉綠素含量為0.09mg/g；在NaCl300mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因生菜葉片相對(duì)含水量為70.95%，而野生型相對(duì)含水量為60.95%；在NaCl300mmol/L時(shí)，野生型植株的MDA含量為4.8