家蠶吡哆醋激酶基因的表達分析.pdf

1、維生素B6(VitaminB6，VB6)為水溶性維生素，是一類吡啶化合物的總稱，游離型有吡哆醛(Pyridoxal，PL)、吡哆醇(Pyridoxine，PN)和吡哆胺(Pyridoxamine，PM)，相應磷酸酯形式為磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)、磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate，PMP)。其中PL

2、P是VB6的主要輔酶形式，參與氨基酸代謝的各種反應。吡哆醛激酶（pyridoxalkinase，PLK）是VB6 關鍵代謝酶，在二價金屬陽離子和ATP 存在下，催化游離形式VB6 各自磷酸化反應，生成相應的磷酸酯型，并且與磷酸吡哆醇氧化酶、磷酸酶一起維持細胞內PLP 濃度的動態(tài)平衡。
　　 我們的前期研究采用生物信息學原理和PCR方法，構建家蠶PLK 融合基因表達質粒pET22b-His-PLK，原核表達純化出重組蛋白，并且分析

3、了家蠶PLK的基本酶學性質，對其蛋白結構也進行了預測。
　　 本研究在此基礎上將融合質粒在大腸桿菌中誘導表達，經親和層析純化，以純化的蛋白為抗原免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，ELISA檢測抗體效價可達到1：51200以上。提取家蠶五齡幼蟲的各組織蛋白，用于Western blot實驗。實驗結果表明，PLK在家蠶的精巢、馬氏管、中腸、表皮、頭部等組織中都有表達，且表達量依次降低，而在絲腺中沒有明顯檢測到該蛋白的存在。我們還利用熒光

4、定量PCR的方法，對家蠶五齡幼蟲各組織中的mRNA的量進行了比較。通過從mRNA水平和蛋白質水平研究PLK基因在家蠶不同發(fā)育時期及幼蟲不同組織中的轉錄、表達情況，明確了PLK在家蠶5齡期不同組織中的功能，為進一步探討PLK在家蠶VB6代謝中的生物學功能提供重要依據。
　　 家蠶既是用于蠶絲生產的重要經濟作物，也是僅次于果蠅作為昆蟲研究的模式生物，同時還是開發(fā)新一代生物反應器和新型昆蟲產業(yè)的材料。家蠶在生長發(fā)育和合成絲蛋白時，體內