家蠶醛氧化酶基因的鑒定與表達(dá)特征分析.pdf

1、隨著后基因組時(shí)代的來臨，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲已漸漸成為基因功能研究的理想遺傳資源。目前，家蠶基因組精細(xì)圖的完成更是為家蠶功能基因組研究提供了豐富的信息。醛氧化酶(AO，EC1.2.3.1)是一類能催化醛類氧化成羧酸并釋放出活性氧的蛋白酶，它屬于鉬-黃素酶(MFE)家族，具有該家族保守的功能域。AO廣泛地存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是有著眾多生理生化功能的重要酶類。它屬丁多基因家族，不同的AO亞型執(zhí)行著不同的生理功能。已有的研究表明，它在植物中參

2、與催化吲哚乙酸與脫落酸的生物合成反應(yīng)；在哺乳動(dòng)物中，參與代謝產(chǎn)物和外源物的氧化降解、視黃酸合成、藥物代謝及肝臟中有毒化合物代謝，還與一些人類疾病的病理相關(guān)，其活性水平已成為醫(yī)學(xué)上臨床用藥及治療效果評估的一個(gè)重要參數(shù)；另外，AO在昆蟲嗅覺的氣味分子降解過程中也起著至關(guān)重要的作用，且與昆蟲抗藥性相關(guān)。但是，作為一種重要的代謝酶類，醛氧化酶在遺傳、進(jìn)化及生理生化功能等方面的信息還相當(dāng)匱乏。本研究利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)，對家蠶醛氧化酶基因(BmA

3、OX)家族進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析，采用RT-PCR、基因克隆、Native-PAGE、組織原位雜交等技術(shù)對BmAOX的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)特征進(jìn)行了分析，同時(shí)對其中兩個(gè)組織特異表達(dá)的BmAOX家族成員作了功能初探。主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶醛氧化酶基因(BmAOX)的鑒定及生物信息學(xué)分析 基于序列的相似性及功能域的保守性，我們在家蠶基因組中對醛氧化酶基因家族作了生物信息學(xué)分析，成功找到了8個(gè)BmAOX候選

4、基因，分別命名為BmAOX1，BmAOX2，BmAOX3、BmAOX4、BmAOX5，BmAOX6，BmAOX7、BmAOX8。它們位于家蠶第18號染色體上，預(yù)測序列含12～20個(gè)外顯子，編碼閱讀框長3201～3831bp，預(yù)測蛋白含1073～1276個(gè)氨基酸殘基，分子量大小為118.5～141.8kDa，等電點(diǎn)為5.18～7.57。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這8個(gè)BmAOX均具有醛氧化酶保守的功能域。進(jìn)化分析表明，它們與昆蟲AO基因聚為一簇。

5、 2.BmAOX在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達(dá)特征 通過RT-PCR和組織蛋白Native-PAGE的AO活性染色方法，對已鑒定出來的8個(gè)家蠶醛氧化酶候選基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)特征做了分析。結(jié)果顯示：BmAOX1，BmAOX2僅在蠶蛾觸角中表達(dá)，BmAOX3僅在蠶蛹生殖腺表達(dá)，BmAOX5僅在雌蛾的性信息腺表達(dá)，這四個(gè)基因具有很強(qiáng)的組織特異性。其中BmAOX1、BmAOX2的表達(dá)特征與已有的報(bào)道一致；BmAOX6在蛹

6、中不表達(dá)，而在蛾的觸角、胸、腹、翅等多個(gè)組織均有表達(dá)，具有時(shí)期特異性。另外，BmAOX4，BmAOX7，BmAOX8在蛹和蛾的多個(gè)組織均有表達(dá)，說明它們在家蠶生理代謝活動(dòng)中起著重要的作用。在蛋白水平上，我們檢測劍家蠶蛹中有5種有活性的酫氧化酶，而蠶蛾中有6種，各組織中均有有活性的BmAOX，只是種類和活性有所不同。 3.生殖腺特異表達(dá)的BmAOX3的克隆及表達(dá)特征分析 對家蠶生殖腺特異表達(dá)的BmAOX3基<進(jìn)行了編碼序列

7、的克隆，獲得了全長為3537bp的完整ORF，編碼的蛋白含1178個(gè)氨基酸，分子量大小為132.7kDa，等電點(diǎn)為8.06。BmAOX3的多序列比對結(jié)果顯示，它具有醛氧化酶高度保守區(qū)域，進(jìn)一步證明了它屬于鉬黃素酶家族的醛氧化酶亞家族。BmAOX3在5齡末期和蛹末期的卵巢中高量表達(dá)，且隨家蠶發(fā)育時(shí)期呈周期性變化，到蛾期停止表達(dá)。而不同時(shí)期卵巢的醛氧化酶蛋白活性檢測結(jié)果顯示：以蛹3天為界，在此之后的卵巢中，醛氧化酶不論從活性還是種類上均人人

8、增加。初步推測：在這個(gè)卵巢處丁新陳代謝旺盛的發(fā)育階段，BmAOX3可能參與其中某一個(gè)或幾個(gè)生理代謝途徑，從而在卵巢的發(fā)育及卵的形成過程中起作用。 4.性信息腺特異表達(dá)的BmAOX5的克隆及表達(dá)特征分析 本研究克隆了雌蛾性信息腺特異表達(dá)的BmAOX5的編碼序列，獲得的完整ORF全長為3737bp，編碼含1245個(gè)氨基酸的蛋白，分子量大小為137.9kDa，等電點(diǎn)為5.54。通過氨基酸序列的多序列比對，證實(shí)BmAOX5具有作

9、為醛氧化酶家族成員所特有的高度保守的功能域。對不同時(shí)期雌蛾性信息腺作BmAOX5的時(shí)期表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)該基因在蛾繁殖時(shí)期有高量表達(dá)。同樣在蛋白活性檢測中也發(fā)現(xiàn)了明顯的醛氧化酶活性帶。以BmAOX5 RNA為探針進(jìn)行組織原位雜交，結(jié)果顯示該基因在性信息腺囊壁和產(chǎn)卵管內(nèi)壁表達(dá)。推測BmAOX5與降解性信息素、調(diào)節(jié)性信息素濃度有關(guān)；同時(shí)該基<可能還參與一般環(huán)境氣味分子的代謝，在家蠶生殖活動(dòng)和產(chǎn)卵場所的選擇中起重要作用。 綜上所述，本研究基

10、于家蠶全基因組數(shù)據(jù)，對家蠶醛氧化酶基<家族進(jìn)行了較為完整的鑒定分析，找到了8個(gè)BmAOX候選基因。從這8個(gè)BmAOX在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)特征看，其中多個(gè)基<都在各組織有表達(dá)，說明它們在家蠶生理代謝活動(dòng)中起著重要的作用。同時(shí)找到了在生殖腺特異表達(dá)的BmAOX3和在雌性信息腺特異表達(dá)的BmAOX5。通過分析BmAOX3的序列及表達(dá)特征，初步認(rèn)為BmAOX3可能參與卵巢的發(fā)育及卵的形成。通過BmAOX5的克隆、時(shí)期表達(dá)譜及組織定位分析，